Membranska tehnologija in razjasnitev cepiv (Ⅱ)

V prejšnjem članku smo imeli nekaj predhodnih uvodov v cepiva in strategije pojasnjevanja cepiv in nadaljevali jih bomo z raziskovanjem v nadaljevanju tega članka. Na podlagi zgoraj navedenega bomo še naprej delili pojasnila o cepivih in povezanih aplikacijah membranskega tkiva.

 

2.2.2 Vpliv fizikalnih in kemijskih lastnosti virusa

Po preučitvi proizvodnega sistema in metod za odstranitev ustreznih kontaminantov v koraku čiščenja je pomembno upoštevati značilnosti virusa in se osredotočiti na maksimiranje donosa virusa.

 

2.2.2.1 Enostavna adsorpcija virusa
Pozitivno nabiti materiali in pripomočki za filtriranje (kot je diatomit) so bili razviti za izboljšanje učinkov globoke filtracije. Čeprav pozitivni naboj poveča zajemanje nukleinskih kislin in HCP, je znano, da diatomit veže celične ostanke in koloide. Vendar lahko ti materiali tudi zadržijo virus prek adsorpcijskega mehanizma. Ker je virus običajno negativno nabit v raztopini, lahko pride do elektrostatičnih interakcij s pozitivno nabitim filtrom.
Virusi se lahko vežejo tudi s svojimi hidrofobnimi ali nespecifičnimi interakcijami z nekaterimi filtrirnimi materiali (kot je diatomit ali steklena vlakna). Virusi z ovojnico so zaradi svoje lipidne ovojnice bolj dovzetni za to adsorpcijo. Če se virus adsorbira na filter z elektrostatičnimi interakcijami in se virusni delci odlepijo zaradi konkurence soli, lahko spiranje filtra z visoko prevodnim pufrom delno obnovi virus. Vendar pa lahko to tudi eluira onesnaževalce, kot so HCP ali nukleinske kisline. Zato je prednostna uporaba alternativnega filtrskega materiala, kot je bolj inertni polipropilen.
Adenovirus is easily adsorbed, but different results have been confirmed. Using positively charged diatomite and deep filters. Borosilicate glass fiber filter material is also very well recovered. On the other hand, a patent proposed by Weggeman involving clarification of 20 – 40% adenovirus losses at PER, et al. Cell cultures were prepared with similarly positively charged deep filters containing diatomite. In this case, the nominal polypropylene filter showed a very high viral recovery rate (> 90%).
Dobro je znano, da so virusi gripe med bistrenjem nagnjeni k izgubi adsorpcije. Zato je uporaba brezplačnega filtra, filtra na osnovi polipropilena, primerna za bistrenje zbiranja gripe. Thompson et al so poročali o uporabi polipropilenskega filtra z nominalno nazivno velikostjo 1,2 μm, ki mu je sledila membrana PVDF 0.45 μm za razjasnitev celičnega virusa influence, ki ga proizvajajo celice MDCK. Izvedenih je bilo skupno devet preskusov čiščenja na lestvici 20L, pri čemer je bila obremenitev 111 L/m2 za 1,2 μm polipropilenski filter in 105 L/m2 za 0,45 μm PVDF filter. Rezultati so pokazali, da se je večina aktivnih virusov dobro opomogla (78-154%). Poročali so tudi o do 58 % odstranitvi hcDNA, vendar brez pomembne odstranitve HCP.

 

2.2.2.2 Izrezovanje občutljivih virusov

Nekateri virusi (inkapsulirani ali neinkapsulirani) kažejo nizko mehansko odpornost in se lahko uničijo zaradi izpostavljenosti strigu med centrifugiranjem in koraki membranske filtracije. Strižne sile, ki nastanejo med koraki čiščenja, ki vključujejo filtracijo ali kromatografijo, lahko povzročijo, da virusna ovojnica odpade, kar vpliva na kužnost. Odvisno od velikosti, debeline in geometrije kapside je lahko virusna kapsida krhka ali, nasprotno, odporna na visoke pritiske. Nekateri virusi z ovojnico, kot so virusi gripe, so elastični za mehanske obremenitve in lahko prenesejo velike deformacije. Po drugi strani pa lahko strižna sila povzroči odpadanje ovojnice manj odpornih virusov, kot so retrovirusi, in tako vpliva na kužnost virusa.

Zelo ranljivi so tudi zunajcelični VLP-ji ovojnice. V centrifugalnem procesu nastajajo visoke strižne hitrosti, predvsem na vstopnem in izstopnem delu (visoke strižne hitrosti nastajajo na meji plin-tekočina). Ko je bil virus očiščen z gradientnim centrifugiranjem, je bila sposobnost transdukcije nekaterih retrovirusov znatno oslabljena. Pri načrtovanju centrifugalne separacije je treba upoštevati relativno nestabilnost virusnih delcev na strižne sile. Centrifugalna sila ni edini vir strižnega šoka, pomembnejša je zasnova opreme, zlasti pri uvozu in izvozu imata tudi pomemben strižni šok. Razlike v zasnovi različnih lestvic lahko vodijo do razlik v donosu in okrevanju virusov, občutljivih na striženje, na različnih lestvicah.

Viruse, občutljive na strig, je treba skrbno načrtovati, ker sta lahko velikost strižne napetosti in čas izpostavljenosti obremenitvi (zaradi recirkulacije) velika. Za viruse, občutljive na strig, so za zmanjšanje turbulence in strižnih sil v dovodnem kanalu prednostne naprave z odprtim tokokrogom (naprave z votlimi vlakni ali odprtimi ploščami).

Izbira delovnih parametrov mora tudi čim bolj zmanjšati poškodbe virusnih delcev: nizek navzkrižni pretok, srednji transmembranski tlak (TMP) in kratek čas obdelave.

Kontaminacija membrane pod visokim pritiskom povzroči izgubo virusne kužnosti, verjetno zaradi sil, ki lahko delujejo na virusno ovojnico. Ločevanje na podlagi membrane temelji na velikosti, kopičenje virusnih inhibitorjev in virusnih delcev z veliko molekulsko maso pa lahko zmanjša infektivnost virusnih vektorjev.

Razgradnja virusov, občutljivih na striženje, med globoko filtracijo ni široko dokumentirana. Izgubo virusov pri globoki filtraciji največkrat pripišemo lovljenju, adsorpciji ali časovno in temperaturno odvisni virusni razgradnji izdelka. Čeprav lahko pride do mehanske obremenitve v sistemih NFF, je čas izpostavljenosti izdelkov NFF strigu zelo kratek v primerjavi z drugimi tehnologijami zaradi hitrega enkratnega prehoda pri izdelkih NFF.

 

2.2.2.3 Prestrezanje glede na velikost odprtine

Viruse, večje od 100 nm, lahko obdržite z odstranitvijo mikoplazemskih ali sterilnih membran (0.22 μm in manj). V tem primeru je treba posebno pozornost nameniti izbiri filtrov. Za korake mikrofiltracije TFF so za dobre kanale produkta prednostne membrane 0.45 μm ali 0,65 μm. Za večstopenjsko filtracijo NFF je najgostejša plast večja ali enaka 0,45 μm. Pri izbiri globinskega filtra morate biti previdni, saj lahko nekatere naprave z globokim filtrom vsebujejo plast filma, kar lahko povzroči izgubo izdelka zaradi zadrževalnega pogona. Združevanje virusa negativno vpliva na proizvodnjo virusa in poveča zadrževanje virusa zaradi velikosti virusa.

Po patentu Andrea in Champluvierja lahko homogenizacija prepreči ali omeji zamašitev filtra z zmanjšanjem velikosti agregata, kar zagotavlja višji izkoristek. Homogenizacija je izboljšala tudi filtracijsko zmogljivost žetve, ki se je povečala za 2.{1}}-krat.

Preveč nečistoč lahko moti okrevanje virusa. Nečistoče ponavadi zamašijo filter, zamašene membranske pore pa lahko povzročijo zmanjšano prehajanje virusa. V patentu de Vochta in Veenstre je omenjeno, da neposredno bistrenje visoke gostote celic Per. Zbiranje z membrano TFF ({{0}}.65 ali 0.2 μm) je povzročilo obnovitev virusa brez adenovirusa. Obnovitev je mogoče doseči s selektivno odstranitvijo DNK gostiteljske celice pred korakom 0,65 μm TFF. 70% adenovirusov.

 

 

2.3 Študija primera: Optimizacija razjasnitve virusnega cepiva

Na mednarodni konferenci o bioloških procesih leta 2011 je Sanofi Pasteur predstavil racionalen pristop k presejalnim filtrom za razvoj novih razjasnjenih zaporedij za kandidatna virusna cepiva. Cilj raziskave je premagati težave, s katerimi se soočajo pri optimizaciji procesov gojenja celic in virusov. Spremembe predhodnega postopka so povzročile 20-odstotno izgubo donosa in prezgodnjo kontaminacijo filtra med korakom bistrenja, zaradi česar ni prišlo do povečanja. Da bi vzpostavili robusten in razširljiv korak razčiščevanja, je bil potreben popoln ponovni razvoj zaporedja filtrov, s stopnjami okrevanja virusa, višjimi od 85 %.

Based on internal experience and scientific publications, the team selected 27 filters for an initial screening study. Small scale virus adsorption tests were performed on various filter media (polypropylene, nylon, cellulose ester, glass fiber, charged adsorption filter) and structures (pleated or deep filter). The virus yield was measured by ELISA and the clarifying efficiency of the preselected filtrate was compared by checking the reduction of turbidity. Preliminary screening studies showed that nylon and charged filters retained viral particles and virus recovery. Ten percent. The virus recovery rate of polypropylene and polyether sulfone filter was >. 80 % Stopnja izkoristka filtrov iz celuloznega estra in steklenih vlaken je odvisna od ocene filtra (20 % ali 90 %).

Kot drugi korak je Sanofi Pasteur ovrednotil več kombinacij (sekvence faze 2 ali faze 3) sedmih filtrov, vnaprej izbranih v presejalni študiji. Preskus klasifikacije s konstantnim pretokom je bil izveden z majhnim filtrom. Poleg tega je bil v tem poskusu uporabljen višji donos kot v presejalni študiji. Na podlagi rezultatov okrevanja virusa in zmogljivosti filtra je ekipa izbrala dve najboljši kombinaciji za nadaljnje študije.

- Zaporedje 1 (stopnja 2): 30 μm nazivno zložen predfilter iz polipropilena, ki mu sledi kompozitni celulozni ester in večplastni filter iz steklenih vlaken (poroznost 1/0,5 μm)

- Zaporedje 2 (stopnja 3): isti predfilter (30 μm nazivni polipropilenski filter), ki mu sledi vmesni večplastni polipropilenski filter in končno asimetrični polieter sulfonski film.

 

The robustness of these two clarified sequences has been challenged by repeated constant flow sizing experiments with different harvest batches. While both potential sequences demonstrated enhanced capabilities compared to the reference sequence, only sequence 1 achieved virus recovery objectives (>85%), kot je prikazano na sliki 1.

Slika 1 Povprečna obnovitev virusa pri vsakem koraku filtriranja. Študije stabilnosti so bile ovrednotene za tri filtracijske sekvence, od katerih je samo sekvenca 1 z uporabo 30 μm nazivno zloženega polipropilena in 1.0/0,5 μm celuloznega estra in filtra iz steklenih vlaken dosegla globalni cilj predelave .

Centrifugiranje je bilo ocenjeno tudi kot primarni korak bistrenja, ki mu je sledila končna filtracija {{0}}.45 μm. Preizkušenih je bilo več parov hitrost/trajanje. Čeprav se je hitrost filtracije 0,45 μm povečala za dvakrat, je bil končni izkoristek nižji od ciljnega 85 %. Zato centrifugiranje ni bilo nadalje raziskano.

Nazadnje je bila učinkovitost filtrirnih sekvenc iz polipropilena in steklenih vlaken ovrednotena v večjem merilu (velikost bioreaktorja 160 L). Zaporedje filtrov je prikazano na sliki 2.

Slika 2 pojasnjuje kombinacijo filtrov in grafično predstavitev stopenjskega donosa niza. Vlak A je tradicionalni postopek, vlak B pa optimiziran postopek. Optimizirano zaporedje B lahko zmanjša območje predfiltracije za 3-krat, prekliče vmesni korak filtracije in zmanjša končno območje filtracije za 10-krat, s čimer poveča globalno okrevanje virusa za 3 %.

Več serij je bilo uspešno očiščenih brez znakov zamašitve filtra, čas postopka v skladu s proizvodnimi omejitvami in donos virusa > petinosemdeset odstotkov. Optimizacija koraka razčiščevanja ni vplivala na nadaljnje korake in ključne lastnosti kakovosti cepiva. Zato je bilo izbrano zaporedje čiščenja uporabljeno v procesu proizvodnje cepiva (bioreaktor velikosti 1000 L) in učinkovitost je bila uspešno potrjena.

 

03 Razjasnitev bakterijskih cepiv

3.1 Premisleki za pojasnitev bakterijskih cepiv

Po Medical Thesaurus (2015) je bakterijsko cepivo opredeljeno kot suspenzija razredčenih ali ubitih bakterij ali njihovih antigenskih derivatov, ki se uporablja za induciranje imunskega odziva za preprečevanje ali zdravljenje bakterijskih bolezni. Na splošno lahko bakterijska cepiva razdelimo v štiri podkategorije glede na vrsto aktivnega antigena. Ta agent je lahko:

- Ubije ali oslabi vse žive bakterije. Znano tudi kot cepivo BCG.

- Čiščenje antigenskih determinant (podenotna cepiva). Cepivo proti antraksu ali acelularno cepivo proti oslovskemu kašlju.

- Bakterijski toksini (toksoidi). Toksoidi proti davici in tetanusu.

- plazmid (pDNA).

Zaradi široke heterogenosti izdelkov družine so izzivi predhodnega in nadaljnjega postopka v veliki meri odvisni od vrste cepiva, ki se proizvaja. Zato se lahko po začetni stopnji fermentacije očisti ali ne očisti, tako da se lahko izvede stopnja bistrenja.

 

3.2 Strategija pojasnjevanja bakterijskega cepiva

3.2.1 Toksoid

Dva najpogostejša toksoida, proizvedena za uporabo v cepivu, sta proti davici in tetanusu, ki ju proizvajata Corynebacterium diphtheriae oziroma Clostridium tetani. Za proizvodnjo obeh cepiv veljajo stroge regulativne zahteve. Tehnično poročilo WHO in njegove priloge vsebujejo jasna priporočila za zagotavljanje kakovosti, varnosti in učinkovitosti cepiv proti tetanusu in davici. Za proizvodnjo obeh cepiv veljajo splošne dobre proizvodne prakse, zaposleni pa morajo biti ustrezno usposobljeni in prejeti obnovitveno cepljenje proti obema boleznima.

GMP strogo zahteva, da je treba dokazati čistost in kakovost končnega izdelka. Po mnenju WHO in EP je treba učinkovitost končnega cepiva proti tetanusu določiti s primerjavo in vivo ali s katero koli drugo dokazano metodo z ustrezno referenčno snovjo, umerjeno v mednarodnih enotah v skladu z mednarodnim standardom za tetanusni toksoid. Posodobljene zahteve glede učinkovitosti so bile objavljene leta 2011 in se lahko razlikujejo glede na metodo ocenjevanja. Dokazati je treba tudi varnost (brez toksinov in obnovitvena toksičnost) vsake serije cepiva. Nazadnje je treba obravnavati stabilnost cepiv, zlasti v realnem času.

 

3.2.2 Plazmidno DNA cepivo

Plazmidna DNK cepiva se uporabljajo za zdravstvene namene živali, več plazmidnih DNK cepiv za uporabo pri ljudeh pa je v različnih fazah razvoja in kliničnega vrednotenja. Po fermentaciji E. coli se bakterije zberejo in razcepijo, da se sprosti plazmidna DNA.

Odstranitev celičnih ostankov običajno dosežemo s centrifugiranjem ali filtracijo. Tema je bila obširno obravnavana v zadnjih publikacijah. V tej publikaciji trenutni postopki in izzivi pDNA navzgor, navzdol in formulacija pDNA.

Avtorji zagotavljajo tudi vpogled v vrzeli na vsakem koraku tipičnega procesa izdelave pDNA in morebitne prihodnje inovacije in/ali trenutne tehnološke vrzeli, ki bi lahko vodile k nadaljnji optimizaciji postopka.

Plazmidna DNK cepiva pripravljamo v dveh korakih. Prvič, bakterijske celice se odstranijo iz gojišča, in drugič, celični ostanki se odstranijo po celični lizi. Odvisno od obsega se celice zberejo s centrifugiranjem ali TFF mikrofiltracijo. Centrifuga z diskom se občasno izvrže pri visoki hitrosti, izkoristek superzvitih plazmidov pa je slab zaradi strižne poškodbe med praznjenjem. Če je treba uporabiti centrifugiranje, je najboljša centrifuga s trdno posodo. Naprave z odprtim kanalom, ploščati TFF z mikrofiltracijskimi membranami 0.1 ali 0.2 μm ali naprave z votlimi vlakni lahko dobro delujejo.

Ker imajo naprave z votlimi vlakni visoko nosilnost, imajo včasih prednost. Običajno ti procesi potekajo pri 3-5-kratni koncentraciji, ki ji sledi 3-5 volumna transfiltracije. Za zmanjšanje striga in boljši nadzor nad polarizacijo membrane so zelo priporočljivi postopki nadzora penetracije. Čeprav so centrifuge stroškovno učinkovitejše pri obsežnih komercialnih operacijah, se pri manjših postopkih zaradi prenosljivosti in enostavnosti delovanja običajno uporablja filtracija.

Za lažjo predelavo so bili uporabljeni flokulanti, vendar lahko povzročijo izgubo izdelka. Nekateri priporočajo tudi uporabo inertnih delcev diatomejske zemlje, čemur sledi vrečasta filtracija.

Cell lysis produces viscous products, including large particles, cell fragments, soluble impurities, fine colloidal particles, and pDNA. Due to the complexity of the material, removing such fine solids is a difficult separation. Gradient density deep filter or open hole structure (>0.45m) membranski filtri so dobri pri odstranjevanju celičnih ostankov. Zaradi močnega zamašitve celičnih ostankov je prednostna filtracija z nizkim pretokom ali nizkim tlakom. Mikrofiltri na osnovi Tff so bili uporabljeni za to stopnjo in industrijske vrečaste filtre. Statično (v mešalni posodi) in kontinuirano (z uporabo statičnega mešalnika v liniji) krekiranje zahteva različne filtre.

 

3.3 Študija primera: Primerjava učinkovitosti centrifugiranja, metod NFF in TFF za razjasnitev toksinov tetanusa

Muniandi et al. primerjali tri različne metode za razjasnitev tetanusnih toksinov in toksoidov iz fermentacijskih tekočin, in sicer centrifugiranje, globoko filtracijo (NFF) in TFF. Testni material je bil proizveden v 400L fermentorju z uporabo modificiranega Millerjevega (MMM) medija. V študiji centrifugiranja so bile celice ločene od srca pri 4000 RPM v posodi 6 × 1L za 60 minut. Vzorci supernatanta so bili vzeti za odkrivanje izločanja toksoida. Globoka filtracija uporablja 0,45 μm in 0,22 μm globoke filtre, ki vsebujejo diatomejsko zemljo in celulozo za bistrenje fermentacijske brozge. Postopek poteka pri temperaturi 35 stopinj in 12psi.

Modul TFF z odprto ploščato ploščo je pri metodi TFF toplotno vezan na membrano PVDF 0.22μm. Postopek bistrenja na osnovi TFF je bil izveden pri hitrosti navzkrižnega pretoka 2000 L/h pri 23 stopinjah, očiščen filtrat pa je bil koncentriran pri hitrosti navzkrižnega pretoka 1000 L/h pri 25 stopinjah z uporabo običajne sendvič membrane TFF 30kD PES. Očiščena mesna tekočina (približno 6 L) se v tem postopku ultrafiltracije 10-krat koncentrira. Testi tetanusnega toksoida so bili izvedeni na koncentriranih vzorcih zadrževalnika, da bi ocenili izločanje izdelka.

Globoka filtracija je povzročila stopnjo izkoristka produkta približno 89 %, pri čemer so enote TFF povzročile stopnjo izkoristka produkta nad 97 %. Postopki mikrofiltracije in ultrafiltracije dosledno zagotavljajo večje izkoristke produkta kot postopek NFF. Ti rezultati temeljijo na testih flokulacije (Lf).

 

04Razjasnitev polisaharidnih cepiv

4.1 Upoštevanje razjasnitve polisaharidnega cepiva

Proizvodni proces nevezanih/prostih polisaharidnih cepiv in sklopljenih polisaharidnih cepiv se začne s kulturo gostiteljske bakterije v fermentorju. Na koncu fermentacije lahko bakterije obdelamo s čistilnimi sredstvi, kot je DOC (natrijev deoksiholat), Triton®X-100 ali drugimi primernimi reagenti za uničenje bakterij in spodbujanje sproščanja polisaharidov. Zaradi velike kapacitete baterije neposredno zbiranje prek NFF ni ekonomsko izvedljivo, saj je pretok lahko zelo nizek. Zato je idealna izbira uporaba centrifuge za ločevanje celičnih grudic. Lahko se uporablja tudi območje mikrofiltracije TFF. Brezcelično središče/penetrant, ki vsebuje polisaharid, ki nas zanima, se dodatno očisti z globokim filtrirnim sistemom NFF, ki mu sledi filtracija z biološko mešanico, nato pa se nadaljuje v nadaljnjo obdelavo za nadaljnje čiščenje.

 

4.2 Strategija pojasnjevanja polisaharidnega cepiva

4.2.1 Prvi postopek pojasnjevanja

Centrifugiranje je ena najpogostejših tehnik za ločevanje celic od fermentacijskih tekočin. Odvisno od lestvice je mogoče izbrati kontinuirano centrifugiranje ali šaržno centrifugiranje. Pomembno je omeniti, da je pravilna optimizacija pogojev centrifugiranja in njihovega delovanja bistvena za uspešno nadaljnje čiščenje. Pri izbiri posebne TFF membrane in velikosti por je pomembno upoštevati molekulsko maso polisaharidov, ki so pogosto veliki in strukturno zapleteni, z molekulsko maso v razponu od približno 500kDa na več kot 1000kDa. Zaradi velike velikosti odprtih por lahko uporaba 0,22 μm, 0,45 μm, 0,65 μm MF membran zagotovi uspešno obnavljanje molekul PS v osmotski raztopini.

 

4.2.2 Postopek sekundarnega razčiščevanja

Bistrost/motnost brezcelične fermentacijske raztopine, ki doseže sekundarno stopnjo bistrenja, je odvisna od specifične bakterije, vrste cepitve, posameznega tipa seruma in tehnike, uporabljene v primarni stopnji bistrenja. Motnost središča se lahko giblje od približno 50 do 150 NTU. Globinski filter frakcijske gostote s pozitivnim nabojem, izdelan iz impregniranega diatomita s polnjenimi celuloznimi vlakni, je mogoče uporabiti za bistrenje in zmanjšanje njegove motnosti na < 5NTU.

Prostornina prepustnosti tega globokega filtra se lahko giblje od približno 150 L/m3 do 250 L/m3. Običajno se očiščena raztopina izdelka filtrira skozi naknadno 0,45 μm biološko podprto redukcijsko membrano ali 0,22 μm sterilizirano membrano, da se odstranijo vsi preostali delci celic, koloidi in potencialni mikroorganizmi.

 

4.3 Študija primera: Razjasnitev središča fermentacijske brozge Streptococcus pneumoniae po centrifugiranju

Celice smo ločili z dodatkom {{0}}.1 % (v/v) fermentacijske brozge Streptococcus pneumoniae tipa 8 (20 L) s kontinuiranim centrifugiranjem. Središče zbiranja je filtrirano skozi dva ločena globoka filtra s pozitivnim nabojem in diatomejsko zemljo, ki vsebujeta celulozna vlakna. Filtrat posameznega globokega filtra je bil nato filtriran skozi membrano PVDF 0,45 μm z bioobremenjeno redukcijsko stopnjo. Vsi filtracijski testi so bili izvedeni v načinu konstantnega pretoka s peristaltičnimi črpalkami. Filtracijski testi z uporabo napolnjenega globokega filtra in fermentacijske brozge Streptococcus pneumoniae serotipa 8 so povzročili padec motnosti s približno 120 NTU na 3 NTU. Preizkusi so bili izvedeni pri pretoku 140.150 L/m2/uro in razliki tlaka na končni točki 20-25 psi, s prostorninskim pretokom približno 180-200 L/m2.

Podobni filtracijski testi so bili izvedeni na fermentacijski brozgi Streptococcus pneumoniae serotipa 19A. Centrifugirana tekočina 19A se zbistri skozi napolnjen globinski filter, ki zmanjša motnost s približno 40 NTU na 3 NTU. Preizkusi so bili izvedeni pri konstantnem pretoku približno 140-160 L/ m2 / uro, volumetrični pretok 200-230 L/ m2 pa je bil dosežen pri končnem tlaku približno 15 psid. Analiza HLPC vzorcev izdelkov, zbranih med preskusi vrednotenja filtracije, ni pokazala pomembne izgube izkoristka za globoko filtracijo ali 0.45 μm (ali 0,22 μm) membrane.

 

05 Zaključek

Razvoj postopkov bistrenja zahteva integracijo več enotnih procesov, kot so centrifugiranje, TFF-MF, globoka filtracija in aseptična filtracija. Optimizacija postopka razjasnitve zahteva razumevanje, kako različne operacije enote vplivajo druga na drugo. Izziv je izbrati tehnologije in orodja (opremo in napeljave) za izpolnitev vse bolj zapletenih zahtev procesnih tekočin, ki jih proizvajajo današnji učinkovitejši bioreaktorji. Povečanje produktivnosti navzgor (virusni titer, celična gostota itd.), celični ostanki in produkti celične lize povečajo težavnost postopka bistrenja in zmedejo izbiro opreme za ločevanje in filtracijo.

Pri izbiri obsega procesa je treba upoštevati zasnovo opreme, enostavnost uporabe in čistočo. To bo zagotovilo učinkovito pretvorbo in varnost operaterja pri ravnanju z zavrženimi filtri. Za razvoj postopka bistrenja je pomembna močna integracija korakov bistrenja, da se zagotovi stroškovno učinkovita predelava pridelka na zgornjem delu verige. Na voljo je vrsta filtrirnih enot, ki olajšajo laboratorijsko testiranje, pilotno proizvodnjo in obdelavo v polni velikosti. Z uvedbo dobro zasnovanega delovnega načrta za povečavo, ki ocenjuje več možnosti razčiščevanja, je mogoče zanesljivo izbrati in prilagoditi velikost filtrov za razčiščevanje, da zaščitite operacije nadaljnjih enot in hkrati zmanjšate operativne stroške.

Razjasnitev cepiva predstavlja več izzivov. Običajno je treba postopek filtracije prilagoditi proizvodnemu sistemu, sredstvu za inaktivacijo ali lizo in predstavitvi antigena, ne nujno cepivom. Tradicionalni postopki cepiva običajno uporabljajo centrifugiranje za začetno bistritev cepiva. Sodobna cepiva z več tehnološkimi platformami in manjšim obsegom obdelave naredijo cepiva bolj primerna za bistrenje z membranskimi tehnologijami. Na novo razvita cepiva z uporabo sodobnih celičnih linij in ekspresijskih sistemov ter z uporabo bolj opredeljenih pogojev celične kulture naredijo številne postopke cepiva bolj ugodne za filtracijo.

 

Vendar pa heterogenost v antigenski komponenti ali "tarčnem antigenu" izdelkov cepiva poveča kompleksnost filtracijskega čiščenja. Antigeni se razlikujejo po velikosti, površinski kemiji in naboju. Te značilnosti vplivajo na izkoristek in predelavo antigenov. Cepiva predstavljajo posebne izzive za razjasnitev, predvsem zaradi velikosti njihovih makromolekul. To skupaj s težavami glede zmogljivosti v zvezi z razjasnitvijo povečuje potrebo po navodilih glede strategij razvoja procesov.

Velikost in obseg komercialne proizvodnje cepiva pomembno vplivata na izbiro tehnologije čiščenja. Ker se nahaja pred procesom, je ustrezna optimizacija čiščenja ključnega pomena za uspeh operacij spodnje enote, kar poveča donos, predelavo in robustnost procesa. Medtem ko centrifugiranje ostaja izvedljiva tehnična možnost za primarno bistrenje, so enote za mikrofiltracijo z odprtim kanalom (TFF) za primarno bistrenje in fini globoki filtri ali membranski filtri za sekundarno bistrenje vse bolj sprejeti v industriji cepiv. To spremembo poganja potreba po hitrejši obdelavi, hitrem razvoju procesov, prenosljivih procesih in izvedbah za enkratno uporabo. NFF ponuja ekonomičen postopek, primeren za majhne in velike možnosti za enkratno uporabo. Zaradi spreminjajočih se regulativnih potreb razpoložljivost predaseptičnih naprav ali modulov za obsevanje gama, zasnovanih za avtoklaviranje, spodbuja hitrejšo prilagoditev tehnologij, ki temeljijo na NFF ali TFF.

Številni klasični postopki cepiva vključujejo razvoj operacij enote za razjasnitev, predvsem zaradi regulativnih omejitev in s tem povezanih visokih stroškov ponovne validacije in ponovne predložitve ali kliničnih preskušanj. Platformski proces, ki uporablja shemo čiščenja na osnovi filtracije, se pogosto uporablja v več bioloških sredstvih z visoko stopnjo uspeha. Primeri in primeri, opisani v tem dokumentu, kažejo, da lahko proizvajalci cepiv dosežejo to raven stabilnosti, ekonomske upravičenosti in uporabnosti za enkratno uporabo z upoštevanjem pristopa predloge.

Druge prednosti filtracije pred centrifugiranjem so virusi, občutljivi na striženje, ali virusi, ki se nagibajo k kopičenju na meji zraka. Ker proizvajalci naprav na trg prinašajo nove izdelke, bodo proizvajalci cepiv še naprej bolje opremljeni za postopek razjasnitve.

 

Kot prvo podjetje v krogu lokalizacije je Guidling Technology zbrala dovolj ustreznih izkušenj pri razjasnitvi cepiva. Guidling Technology je razvojno in proizvodno podjetje, ki se osredotoča na biofarmacevtsko in celično kulturo, čiščenje in ločevanje. Izdelki se pogosto uporabljajo v biomedicini, diagnostiki, industrijski filtraciji tekočin, detekciji, razjasnitvi, čiščenju in procesu koncentracije; Guidling je uspešno razvil ultrafiltracijsko centrifugalno cev, ultrafiltracijsko/mikrofiltracijsko membransko kaseto, filter za odstranjevanje virusov, tangencialno pretočno filtrirno napravo, globok membranski sklad itd., ki v celoti izpolnjujejo scenarije uporabe biofarmacevtskih in celičnih kultur.

Naše membrane in membranski filtri se pogosto uporabljajo pri koncentraciji, ekstrakciji in ločevanju predfiltracije, mikrofiltracije, ultrafiltracije in nanofiltracije. Naša široka paleta proizvodnih linij, od majhnih laboratorijskih filtrov za enkratno uporabo do proizvodnih filtrirnih sistemov, testiranja sterilnosti, fermentacije, celične kulture in več, lahko zadovolji potrebe testiranja in proizvodnje.