Postopek čiščenja v-industrijskem obsegu za cepivo proti govejemu infekcijskemu rinotraheitisu (IBR) – oddelek »Ultrafiltracija«
Goveji infekcijski rinotraheitis (IBR) povzroča okužba z virusom govejega infekcijskega rinotraheitisa (IBRV), znanim tudi kot goveji herpesvirus tipa 1 (BHV-1). Za bolezen so značilni predvsem respiratorni simptomi in splav. Poleg teh kliničnih manifestacij lahko IBR povzroči zmanjšano mlečnost pri govedu molznicah in zmanjšano povečanje telesne mase pri govedu za meso, kar povzroči znatne gospodarske izgube za živinorejske farme.
Bolezen ima imunosupresivno naravo. Ko se pojavi kot ena sama okužba, je njena patogenost razmeroma nizka; če pa pride do mešanih okužb z drugimi virusnimi ali bakterijskimi boleznimi, se resnost in škoda znatno povečata. Cepljenje je najučinkovitejša metoda za preprečevanje in nadzor, saj sta na voljo dve glavni vrsti cepiv: živa oslabljena cepiva in inaktivirana cepiva. Trenutno so cepiva proti govejemu infektivnemu rinotraheitisu, ki se uporabljajo na kmetijah, večinoma inaktivirana cepiva.
Za živa oslabljena cepiva je značilna močna imunogenost, hiter pojav imunosti in dolgo trajanje zaščite (običajno več kot šest mesecev). Običajno se uporabljajo za nujno cepljenje med izbruhi bolezni. Vendar pa predstavljajo potencialno tveganje za širjenje virusa, predstavljajo tveganje za breje krave in jih ni mogoče uporabiti pri latentno okuženem, vendar asimptomatskem govedu.
Za inaktivirana cepiva je značilna visoka varnost, brez tveganja izločanja virusa ali vrnitve virulence in veljajo za popolnoma varna. Uporabljajo se lahko pri govedu v vseh fazah, vključno z brejimi kravami, teleti in plemenskimi biki. Vendar pa je začetek imunosti razmeroma počasen in trajanje zaščite je krajše, zato so običajno potrebna obnovitvena cepljenja. V nekaterih primerih je lahko zaščitna učinkovitost šibkejša od učinkovitosti živih oslabljenih cepiv.
Ne glede na to, ali se uporablja živo oslabljeno cepivo ali inaktivirano cepivo, lahko nadaljnji postopek čiščenja razdelimo na štiri glavne stopnje: žetev in bistrenje → koncentracija in primarno čiščenje → čiščenje s poliranjem → inaktivacija/sterilna filtracija in formulacija.
Koncentracija je ključni korak v nadaljnjem procesu čiščenja cepiv, takoj po bistrenju. Njegov glavni cilj je hitro zmanjšati zbrano veliko-volumensko, nizko-koncentrirano očiščeno raztopino z virusom v majhno-volumensko, visoko-koncentrirano obliko ob ohranjanju virusne bioaktivnosti. To ustvarja potrebne pogoje za nadaljnje korake finega čiščenja z visoko-ločljivostjo, a nizko{7}}zmogljivostjo, kot je kromatografija.
Ta korak se običajno izvede z ultrafiltracijo s tangencialnim tokom (TFF). Načelo je naslednje: virusna napajalna raztopina teče vzporedno s površino ultrafiltracijske membrane z določeno velikostjo por. Pod pritiskom gredo majhne molekule, kot so voda, soli in nekatere nečistoče, pravokotno skozi membrano in se odstranijo, nedotaknjeni delci virusa, ki so veliko večji od membranskih por, pa se zadržijo, neprekinjeno krožijo in koncentrirajo. V primerjavi s tradicionalnim-hitro-centrifugiranjem je ta metoda nežnejša za krhke viruse, kot je IBRV, ki imajo lipidno ovojnico. Učinkovito zmanjšuje strukturno poškodbo virusa in izgubo aktivnosti, ki jo povzročajo visoke strižne sile, in je bolj primeren za linearno povečanje-za industrijsko proizvodnjo.
Uspešna operacija koncentracije je veliko več kot le zmanjšanje količine. Ključne točke za optimizacijo procesa vključujejo: natančen nadzor nad transmembranskim tlakom in hitrostjo dovodnega toka za uravnoteženje učinkovitosti filtracije, hkrati pa minimizira koncentracijsko polarizacijo in umazanijo membrane; izbira ustreznega membranskega materiala in velikosti por za zagotovitev visokega zadrževanja virusa in pretoka permeata; in iskanje optimalnega ravnovesja med okrevanjem virusa, faktorjem koncentracije in časom obdelave. Koncentrirana virusna suspenzija ne doseže samo znatno višjega titra, temveč doseže tudi predhodno čiščenje z odstranitvijo velikega dela vodo{2}}topnih nečistoč. To zagotavlja potreben volumen in osnovo za koncentracijo za nadaljnje kritične korake rafiniranja, kot sta kromatografija in obdelava z nukleazo, zaradi česar je koncentracija osrednje središče učinkovitosti v celotnem nadaljnjem procesu.
Sekundarna diafiltracija je kritičen korak pri nadaljnjem čiščenju cepiva, postavljen po finem čiščenju in pred formulacijo. Običajno se izvaja po obdelavi s kromatografijo in nukleazo. Njegov glavni namen ni začetna koncentracija, temveč sistemska izmenjava in natančna prilagoditev pogojev končne formulacije. Postopek se izvaja v sistemu ultrafiltracije s tangencialnim tokom (TFF), kjer se krožeči koncentrirani virusni raztopini nenehno dodaja svež, čist pufer za formulacijo, medtem ko se prvotno topilo in majhne -molekulske nečistoče odstranijo. Ta postopek učinkovito in nežno odstrani ostanke soli, organska topila, produkte razgradnje nukleaze in sledi topnih nečistoč, ki ostanejo po postopku čiščenja.
Ključno je ohraniti konstanten volumen ali uporabiti manjše prilagoditve koncentracije, da zagotovite, da koncentracija virusa ustreza specifikacijam formulacije. Za krhke viruse z ovojnico, kot je virus govejega infekcioznega rinotraheitisa (IBRV), je nežno hidrodinamično okolje sekundarne diafiltracije ključnega pomena za ohranitev celovitosti in imunogenosti delcev. Končno ta korak zagotavlja trdno osnovo za poznejšo inaktivacijo (če je potrebna), dodajanje adjuvansa ali stabilizatorja in končno polnjenje, kar zagotavlja, da končni izdelek vstopi v formulacijo z določenimi komponentami, enotnimi pogoji in dobro združljivostjo. Zato je to eden od ključnih korakov za zagotavljanje varnosti cepiva, stabilnosti in doslednosti med serijami--.
IBRV je dvojno{0}}verižni linearni DNA virus z ovojnico s približno sferično ovojnico. Zreli delci IBRV imajo premer približno 160–230 nm. Skladno s tem lahko uporaba ultrafiltracijskih membran 100, 300 ali 500 kDa zadrži IBRV, hkrati pa odstrani nekatere kontaminirajoče beljakovine. Stopnja predelave ultrafiltracije membranskih kaset Jiuling Technology se razlikuje glede na vrsto dovodnega materiala, vendar na splošno doseže 90–95 %.