Študija o postopku razčiščevanja fermentacijskega lizata visoke gostote rekombinantne bakterije Escherichia coli
Da bi zmanjšali motnje materialne tekočine v kromatografiji in izboljšali pridobivanje ciljnega proteina, so preučevali postopek bistrenja fermentacijskega lizata visoke gostote dveh sevov rekombinantne bakterije Escherichia coli. Izbrana sta bila seva BL21-HP1036 in BL21-palA, ki izražata ključne gene Streptococcus suis in Haemophilus parasuis. Za ovrednotenje izkoristka beljakovin z motnostjo in detekcijo z elektroforezo so bili uporabljeni postopek tangencialnega toka, postopek visoke hitrosti centrifugiranja in postopek bistritve membranske kasete.
Rezultati so pokazali, da je bil BL21-HP1036, BL21-palA fermentacijski lizat visoke gostote, ki izraža ključne gene Streptococcus suis in Haemophilus parasuis, očiščen z membransko kasetno filtracijo in centrifugiranjem, izkoristek beljakovin pa je bil več kot 80 %. kar bi lahko učinkovito zmanjšalo kromatografske motnje in izboljšalo stopnjo predelave.
Uvod
Trenutno sta Streptococcus suis (SS) in Haemophilus parasuis (HPS) najpogostejša povzročitelja bakterijskih bolezni v prašičjih farmah, ki prašičereji povzročata velike izgube. SS lahko razdelimo na skupno 35 serotipov 1-34 in 1/2, HPS pa lahko razdelimo na 1-15 serotipe, ki sta pogosto mešana in povzročata predvsem prašičji poliserozitis, artritis, meningitis, endokarditis , bakterijska septikemija in bronhitis.
Zaradi velikega števila serotipov Streptococcus suis in Haemophilus parasuis je navzkrižna zaščita med različnimi serotipi šibka, odpornost na antibiotike pa se bo ob zdravljenju z antibiotiki znatno povečala, kar bo vplivalo na terapevtski učinek.
Cepiva so postala eno od učinkovitih sredstev za preprečevanje SS in HPS. Obstajajo inaktivirana cepiva, oslabljena cepiva, živa cepiva, podenotna cepiva in gensko spremenjena cepiva, vendar so na trgu predvsem inaktivirana cepiva in oslabljena cepiva, njihova imunska zaščita pa je dobra, vendar navzkrižna zaščita ni očitna. Subunit vaccine je nova vrsta cepiva proti Streptococcus suis, ki je nova vrsta cepiva z močno navzkrižno zaščito in nizko ceno. Raziskave in razvoj podenotnih cepiv Streptococcus suis in Haemophilus parasuis zagotavljajo popolno rešitev za težave pri preprečevanju in obvladovanju Streptococcus suis in Haemophilus parasuis, ki pestijo prašičjo industrijo na Kitajskem.
Cepivi Streptococcus suis in Haemophilus parasuis podenote so izpostavljeni fermentaciji z visoko gostoto z rekombinantno Escherichia coli. Očiščenje lizata ima velik učinek na izkoristek ciljnih proteinov, vendar je ustreznih poročil malo. Pomembno delo je, kako uresničiti korak čiščenja fermentacije in postopka čiščenja. V tem dokumentu je rekombinantna E. coli BL21-HP1036, BL21-palA fermentacija visoke gostote kot predmet preučevanja, kako učinkovito zmanjšati motnost raztopine za bistrenje, izboljšati izkoristek beljakovin, za Postopek fermentacije cepiva podenote Streptococcus suis za doseganje tehnologije industrijskega drobljenja in bistrenja za zagotavljanje teoretične osnove in tehnične podpore.
1. Materiali in metode
1.1 Materiali
1.1.1 Sevi
Sevi Streptococcus suis in Haemophilus parasuis BL21-HP1036, BL21-pa-lA
1.1.2 Glavni mediji in reagenti
Ekstrakt kvasa in pliskavke; natrijev klorid; kanamicin, IPTG; Formaldehid iz; Komplet za gel SDS-PAGE.
1.1.3 Glavna preskusna oprema
Fermentor visoke gostote; Visokohitrostna centrifuga; Aparati za elektroforezo; Ultravijolični gelski sistem za slikanje; Ultrazvočni drobilnik; Majhna visokohitrostna centrifuga; Ultravijolični spektrofotometer; Stresna miza s konstantno temperaturo; Oprema za afinitetno kromatografijo.
1.2 Metode
1.2.1 Fermentacijska kultura visoke gostote
Kvalificirana rekombinantna koliformna seva BL21-HP1036 in BL21-pa-lA smo cepili na sintetično gojišče pri 2 % (V/V) in gojili pri 37 stopinjah 35-40 h.
1.2.2 Ekspresija, povzročena z rekombinantnimi beljakovinami
Ko je fermentacijska raztopina OD{{0}}±0.1, se je začela indukcija, indukcijska temperatura je bila 35 stopinj ±0,5 stopinje, gojenje pa je bilo končano po 10 urah indukcije.
1.2.3 Visokotlačno homogeno drobljenje in centrifugiranje
Bakterijska tekočina, ki je prestala test inaktivacije, je bila zdrobljena z visokotlačnim homogenizatorjem za razpokanje celic s tlakom 100 ~ 150 MPa. Po drobljenju smo zdrobljeno tekočino hranili pri nizki temperaturi.
Supernatant je bil pridobljen s centrifugiranjem pri visoki hitrosti, centrifugalna hitrost: 15000 vrt/min, nadzor temperature: 10 stopinj ~15 stopinj, hitrost vbrizgavanja: 0,5~1 L/min, supernatant je bil zbran in supernatant je bil napolnjen z vsebniki, ki so odstranili endotoksin.
1.2.4 Bistritev kasete z mikrofiltracijsko membrano
Membrano smo sprali z 10L prečiščene vode v eno smer in izvedli tangencialno pretočno filtracijo. 300 mL zlomljene bakterijske suspenzije po centrifugiranju smo vzeli iz cevovodne centrifuge in zbistrili z 0,45 um mikrofiltracijsko membransko kaseto. Motnost smo izmerili z vzorčenjem in primerjali motnost po centrifugiranju, motnost očiščene tekočine v kaseti mikrofiltracijske membrane in motnost koncentrirane tekočine v kaseti mikrofiltracijske membrane. Vsebnost beljakovin v vzorcu smo zaznali s kromatografijo in elektroforezo, da bi ocenili izkoristek beljakovin.
2. korak: Rezultati
2.1 Podatki o razjasnitvi in rezultati testiranja proteina BL21-HP1036 in BL21-palA
Rezultati na sl. 1 kažejo, da se je motnost BL21-HP1036 in BL21-palA rekombinantne tekočine za drobljenje bakterije Escherichia coli zmanjšala z 4 500 NTU in 4 000 NTU na 1970 NTU oziroma 520 NTU, po centrifugiranju cevi. Motnost BL21-HP1036 in BL21-palA rekombinantne bakterije Escherichia coli je bila zmanjšana na 25 NTU in 1,28 NTU z mikrofiltracijsko membransko kasetno metodo. Vidimo lahko, da uporaba mikrofiltracijske membranske kasetne filtracije s tangencialnim pretokom in optimiziranega odprtega pretočnega kanala dobro vpliva na zmanjšanje endotoksina, viskoznosti in motnosti kromatografske tekočine kot tradicionalna centrifugalna filtracija in lahko znatno zmanjša razbit rekombinantni heteroprotein E. coli in nukleinske kisline.
2.2 Izločanje beljakovin vzorcev BL21-HP1036 in BL21-palA
Tabela 1 prikazuje, da rekombinantni protein Escherichia coli BL21-HP1036 obstaja tako v raztopini, očiščeni z mikrofiltracijo, kot v koncentriranem supernatantu, prekritem z membrano za mikrofiltracijo, in skupni izkoristek beljakovin po pridobitvi beljakovin iz raztopine, očiščene z mikrofiltracijo, in koncentriranega supernatanta. je približno 88,5 %. Protein BL21-palA je obstajal tudi v očiščeni raztopini mikrofiltracijskega eksudata in supernatantu koncentrirane raztopine, prekritega s kaseto mikrofiltracijske membrane. Skupni izkoristek proteina BL21-PALa je bil 81,5 %.
3. Zaključek
V tem prispevku so sevi, ki izražajo ključne gene BL{{0}}HP1036 in BL21-palA Streptococcus suis oziroma Haemophilus parasuis, podvrženi fermentaciji z visoko gostoto in prestali 0,45. Motnost materialne tekočine je bila bistveno zmanjšano s postopkom kasete z mikrofiltracijsko membrano um, kar kaže, da je bila tehnologija filtracije tangencialnega toka z mikrofiltracijsko membransko kaseto boljša od tiste s centrifugo visoke hitrosti in bi lahko znatno zmanjšala nečistočo beljakovino in nukleinsko kislino zdrobljene rekombinantne bakterije Escherichia coli.
Po zbiranju čiste tekočine v kaseti z enojno mikrofiltracijsko membrano je bilo 62,9 % Ker je bilo 37,1 % ciljnega proteina BL21-HP1036 koncentrat za mikrofiltracijo ali je obstajal v kaseti z mikrofiltracijsko membrano in druge izgube , je bila za pojasnitev sprejeta dvostopenjska metoda. V prvem koraku je bila za čiščenje in zbiranje eksudata uporabljena 0,45 um mikrofiltracijska membranska kaseta; v drugem koraku je bila preostala koncentrirana tekočina zbrana po centrifugiranju v epruveti in dvostopenjska očiščena tekočina je bila združena kot kromatografski vzorec. Vrednost motnosti fermentacijske tekočine BL21-palA se ni bistveno povečala, izkoristek beljakovin je lahko dosegel več kot 85,5 %, izkoristek beljakovin fermentacijske tekočine BL21-Pala pa bi lahko dosegel 81,5 % po obdelavi v dveh korakih.
Glede tega, kako izbrati kaseto z mikrofiltracijsko membrano, vam lahko Guidling Technology zagotovi visokokakovostne rešitve. Naši izdelki serije kaset z mikrofiltracijsko membrano in ultrafiltracijsko membrano kot nosilec uporabljajo polieter sulfon, posebej zasnovan za biotehnologijo. Naša polieter sulfonska membrana ima prednosti visoke prepustnosti, nizke adsorpcije beljakovin, visoke mehanske trdnosti, odpornosti na udarce in tako naprej. Zagotavljamo vam posebne membranske spone za merjenje tlaka na dovodu in izhodu v realnem času ter lahko zagotovimo tehnične obiske glede na vaše potrebe za prilagoditev vašega posebnega ultrafiltracijskega/mikrofiltracijskega sistema. Tak majhen tangencialni pretočni sistem se lahko uporablja za majhno, pilotno in majhno proizvodnjo ter je lahko popolnoma linearna ojačanja, da v celoti izpolni vaše zahteve glede testiranja in proizvodnih zahtev.
O Guidlingu
Guidling Technology je nacionalno visokotehnološko podjetje, ki se osredotoča na biofarmacevtiko, celično kulturo, čiščenje in koncentracijo biomedicine, diagnostiko in industrijske tekočine. Uspešno smo razvili centrifugalne filtrirne naprave, ultrafiltracijske in mikrofiltracijske kasete, virusni filter, sistem TFF, globinski filter, votla vlakna itd., ki v celoti izpolnjujejo scenarije uporabe biofarmacevtskih izdelkov, celične kulture itd. Naše membrane in membranski filtri se pogosto uporabljajo pri koncentraciji, ekstrakciji in ločevanju predfiltracije, mikrofiltracije, ultrafiltracije in nanofiltracije. Naše številne linije izdelkov, od majhnih laboratorijskih filtrov za enkratno uporabo do proizvodnih filtracijskih sistemov, testiranja sterilnosti, fermentacije, celične kulture in več, izpolnjujejo potrebe testiranja in proizvodnje. Guidling Technology se veseli sodelovanja z vami!
