Popolna analiza postopka izdelave zdravil MRNA: Kako tehnologija TFF rešuje izzive čiščenja
V zadnjih letih je tehnologija mRNA dosegla preboj na biofarmacevtskem področju in pokazala izjemen potencial uporabe, zlasti pri cepivih in genski terapiji. Uspešen razvoj cepiv mRNA ni le zagotovil novih rešitev za preprečevanje in obvladovanje nalezljivih bolezni, temveč je spodbudil tudi napredek v imunoterapiji raka in personalizirani medicini. Kot nov razred terapevtskih izdelkov je proizvodnja mRNA v-velikem obsegu zelo zahtevna, saj vključuje nadzor stabilnosti RNA, odstranitev ostankov encimov in reakcijskih stranskih-produktov, izmenjavo pufra in doseganje visokih-stopenj obnovitve čistosti, kar vse zahteva proizvodne tehnologije z regulativno-odobrenimi rešitvami.
Proizvodni proces mRNA cepiv ali terapevtikov je v glavnem razdeljen na tri stopnje: priprava osnovne raztopine plazmidne DNA, priprava osnovne raztopine mRNA in priprava zdravila mRNA-LNP.
Diagram poteka postopka izdelave zdravil mRNA
Tangencialna pretočna filtracija (TFF), kot-uveljavljena tehnologija ločevanja membran, se široko uporablja pri proizvodnji mRNA zaradi visoko{1}}učinkovite zmožnosti molekularnega sejanja, nadzorovane izmenjave pufra in lastnosti nizke strižne napetosti. Na podlagi zasnove membranskega modula običajne konfiguracije TFF vključujejo ploščate-kasete in module z votlimi-vlakni. Poleg tega lahko tlačno{6}}membransko ločevanje v TFF razvrstimo v mikrofiltracijo (MF), ultrafiltracijo (UF), nanofiltracijo (NF) in reverzno osmozo (RO) glede na velikost membranskih por s postopno naraščajočo selektivnostjo.
TFF ima ključno vlogo v več fazah proizvodnje zdravil mRNA, vključno s pripravo mase plazmidne DNA, množično proizvodnjo mRNA in končno formulacijo zdravilnih produktov mRNA-LNP. Z ustrezno izbiro vrste membrane, molekulske teže (MWCO) in membranskega materiala TFF omogoča učinkovito odstranjevanje reakcijskih stranskih-produktov in nečistot z nizko{3}}molekularno-težo, hkrati pa olajša izmenjavo pufra in koncentracijo pred in po inkapsulaciji LNP. To znatno poveča čistost, stabilnost in splošno razširljivost procesa RNA.
Poleg tega na delovanje filtracije tangencialnega toka vplivajo dejavniki konfiguracije sistema, kot sta tip črpalke in zasnova cevi, ter ključni procesni parametri, vključno s transmembranskim tlakom (TMP), strižno napetostjo in filtracijskim tokom. Te dejavnike je treba skrbno izbrati in optimizirati na podlagi značilnosti ciljnega izdelka, zlasti za-občutljive izdelke na stres, kot je mRNA–LNP, ki so zelo dovzetni za zunanje mehanske sile med obdelavo.
Čiščenje plazmidne DNA
Priprava osnovne raztopine plazmidne DNA v osnovi temelji na zasnovi zaporedja transkripcijske predloge. Metode priprave običajno vključujejo pomnoževanje plazmidne DNA, čeprav se lahko uporabi tudi pomnoževanje PCR. Če vzamemo za primer pomnoževanje DNK, inženirstvoE. colise običajno uporablja za pomnoževanje-na podlagi fermentacije. Nadaljnji postopek čiščenja vključuje predvsem zbiranje celic, lizo in bistrenje, koncentracijo in izmenjavo pufra, sterilno filtracijo, linearizacijo in kromatografsko čiščenje. V industrijskih okoljih se za zbiranje celic pogosto uporablja-centrifugiranje s stalnim tokom, vendar ustvarja razmeroma visoke strižne sile. Sistemi z votlimi vlakni so s svojimi odprtimi kanali in nizkim strigom bolj primerni za ravnanje z vzorci z visoko vsebnostjo trdnih snovi, visoko viskoznostjo ali občutljivostjo na striž, kot je plazmidna DNA. Po zbiranju so celice podvržene homogenizaciji pod visokim{6}}tlakom, ultrazvočni obdelavi ali alkalni lizi, čemur sledi predhodno bistrenje z globinsko filtracijo.
Za lažjo kasnejšo kromatografijo se za koncentracijo in izmenjavo pufra pogosto najprej uporabi tangencialno pretočno filtriranje (TFF) z uporabo membranskih kaset ali kolon z votlimi vlakni z mejnimi vrednostmi molekulske mase 30 kDa, 100 kDa ali 300 kDa. To zmanjša količino vzorca, hkrati pa odstrani nekatere nečistoče, kot so RNA, proteini gostiteljskih celic (HCP) in fragmenti DNA gostiteljskih celic (HCD). Kromatografija služi kot stopnja čiščenja jedra. Običajno se anionsko izmenjevalna kromatografija (AEX) kombinira s hidrofobno interakcijsko kromatografijo (HIC) za učinkovito odstranjevanje nečistoč in obogatitev visoko bioaktivne superzvite plazmidne DNA, s čimer se znatno izboljša čistost plazmida.
Po čiščenju se plazmid ponovno izpostavi TFF, da se raztopina koncentrira na ciljno koncentracijo (običajno 0,5–2 mg/mL) in izvede dializa s končnim pufrom za shranjevanje. Ta korak odstrani ostanke soli in organskih topil iz procesa, s čimer zagotovi, da puferski sistem izpolnjuje zahteve za nadaljnje in vitro transkripcijske (IVT) reakcije.
Čiščenje in vitro prepisane (IVT) mRNA
Transkripcija in vitro (IVT) in modifikacija sta ključna procesa za pripravo osnovnih raztopin mRNA. Med proizvodnjo mRNA IVT se uporablja kombinacija tangencialne pretočne filtracije (TFF1) – kromatografije – tangencialne pretočne filtracije (TFF2). Ta strategija zagotavlja učinkovito in visoko{4}}kakovostno čiščenje mRNA, kar zagotavlja ključno podporo za proizvodnjo cepiva.
Po končanih reakcijah transkripcije in modifikacije se običajno najprej izvede ultrafiltracija/diafiltracija z uporabo membranskih kaset ali kolon z votlimi vlakni z mejnimi vrednostmi molekulske mase 30 kDa, 100 kDa ali 300 kDa. Ta korak učinkovito odstrani različne nečistoče,-povezane s procesom, iz reakcijskega sistema, kot so RNA polimeraza, preostali fragmenti DNA, nereagirani NTP, omejevalni encimi, dvojno{6}}verižna RNA (dsRNA) in zaviralci majhnih-molekul, hkrati pa doseže izmenjavo pufra. Po eni sami stopnji filtracije s tangencialnim tokom se večina nečistoč učinkovito odstrani, edina zaznavna preostala beljakovinska nečistoča pa je RNA polimeraza.
Nato se za nadaljnje čiščenje uporabi več kromatografskih tehnik. Običajno uporabljene metode vključujejo afinitetno kromatografijo, -ekskluzijsko kromatografijo, ionsko{2}}parno reverzno{3}}fazno kromatografijo in ionsko-izmenjalno kromatografijo. S to kombinacijo ultrafiltracije in sekvenčne kromatografije doseže mRNA visoko stopnjo čistosti.
Za izpolnjevanje zahtev glede formulacije ali shranjevanja se osnovna raztopina mRNA ponovno koncentrira ali razredči z uporabo 30 kDa, 100 kDa ali 300 kDa membranskih kaset ali kolon z votlimi vlakni, da se natančno prilagodi ciljna koncentracija in zamenjava v pufer končne formulacije. Nazadnje se uporabi sterilna-filtracija za nadzor mikrobne obremenitve, s čimer se zaključi začasno shranjevanje in polnjenje materiala.
Exploration of TFF-related process parameters: Relevant studies have shown that a membrane with a molecular weight cut-off (MWCO) of 100 kDa provides the optimal purification efficiency; the transmembrane pressure (TMP) should not exceed 5 psi; and an mRNA concentration of 1 mg/mL ensures a relatively high permeate flux (>25 LMH).
Čiščenje formulacij mRNA-LNP
Lipidni nanodelci (LNP) so trenutno najobsežneje raziskani sistem dostave za terapevtike mRNA. Trenutno so različne formulacije mRNA-LNP v različnih stopnjah predkliničnega in kliničnega razvoja. LNP so zelo občutljivi na proizvodne procese. Med operacijami enote, ki so potrebne za proizvodnjo mRNA-LNP, koncentracija in izmenjava pufra s filtracijo s tangencialnim tokom (TFF) ter sterilna filtracija predstavljata pomembne izzive. Te korake je treba skrbno optimizirati, da zagotovimo razširljivost procesa in kakovost izdelka, hkrati pa se izognemo težavam, kot sta umazanija membrane in nepravilno nalaganje filtra.
Po enkapsulaciji mRNA se za čiščenje uporabi tangencialna filtracija (TFF). Namen tega koraka je odstraniti neinkapsulirano mRNA, proste polimere ali lipidne materiale ter ostanke topil iz mRNA in lipidov. Ker imajo mRNA-LNP omejeno stabilnost pri sobni temperaturi, je optimizacija nadaljnjih procesov, vključno s TFF, ključna za ohranjanje kakovosti izdelka.
Ključne usmeritve optimizacije vključujejo: ustrezno nastavitev transmembranskega tlaka (TMP) in tangencialnega pretoka na podlagi velikosti delcev in stabilnosti mRNA-LNP za uravnoteženje učinkovitosti filtracije in napetosti delcev; izbiranje membran ali kolon z votlimi vlakni s primernimi izrezi -molekularne mase (MWCO, npr. 100 kDa ali 300 kDa) za učinkovito odstranjevanje proste mRNA, nečistoč in izmenjalnega pufra ob zmanjšanju adsorpcije ali poškodbe delcev; in optimizacijo koncentracije in volumnov diafiltracije, da se zagotovi učinkovita izmenjava pufra v ciljno formulacijo in nadzor končne koncentracije in disperzije delcev.
Poleg tega je treba med postopkom pozorno spremljati kritične atribute kakovosti (kot so velikost delcev, indeks polidisperznosti [PDI] in učinkovitost enkapsulacije mRNA), parametre pa dinamično prilagajati na podlagi-podatkov v realnem času, da se doseže stabilno, razširljivo in učinkovito čiščenje in formulacija mRNA-LNP.
Poleg tega se zaradi nestabilnosti mRNA-LNP in njihovih komponent pri metodah končne sterilizacije za odstranjevanje bakterij in drugih mikrobnih kontaminantov običajno uporablja 0,2 µm sterilni-filter.