Uporaba ultrafiltracije pri proizvodnji človeškega cepiva proti steklini
Za spodbujanje uporabe ultrafiltracije pri proizvodnji človeškega cepiva proti steklini je bila uporabljena 300kDa ultrafiltracijska membranska kaseta za koncentriranje raztopine žetve virusa stekline in zaznavanje rekuperacije antigena, stopnje odstranitve endotoksina in hitrosti odstranitve gostiteljskega proteina po ultrafiltraciji. Rezultati so pokazali, da je bila pod ustreznim pritiskom raztopina odvzetega virusa stekline koncentrirana 80-krat, eluirana 25-krat, stopnja rekuperacije antigena je bila 86.2 %, stopnja odstranitve bakterijskega endotoksina je bila 87,5 % ~ 88,7 % in stopnja odstranitve beljakovin gostitelja je bila 91,6 %.
Predgovor
Steklina je tradicionalna, starodavna zoonotska bolezen, ki jo povzroča virus stekline (RV), s stopnjo smrtnosti do 100 %. Trenutno ni učinkovitega zdravljenja po izpostavljenosti (tj. poškodbe kože in sluznic), razen cepiva za nujne primere in cepljenja z imunoglobulini. Glavni vir stekline pri ljudeh so ugrizi bolnih ali potencialno okuženih živali (predvsem psov). Umrljivost zaradi stekline je na Kitajskem na drugem mestu na svetu, steklina pa je eden od problemov, ki ogroža javnozdravstveno varnost v naši državi. Kapsularni glikoprotein virusa stekline, ki je edini ključni antigen, ki inducira nastajanje zaščitnega nevtralizirajočega protitelesa, je bil v središču raziskav in razvoja novih cepiv ter novih tehnologij za diagnosticiranje in zdravljenje virusa stekline.
Virus stekline spada v rod virusa stekline iz družine rabdovirusov. Oblika nukleokapsida je elastična, nukleokapsida je vijačno simetrična, površina pa ima ovojnico, ki vsebuje enoverižno RNA. To je patogen, ki povzroča steklino. Virus stekline ima dva glavna antigena: prvi je glikoproteinski antigen na zunanji membrani virusa, ki se lahko veže na receptor za acetilholin in povzroči nevrotoksičnost virusa ter proizvaja nevtralizirajoča protitelesa in protitelesa, ki zavirajo hemaglutinacijo v telesu, nevtralizirajoča protitelesa pa imajo zaščitni učinek; Drugi je notranji riboproteinski antigen, zaradi katerega lahko telo proizvede protitelesa, ki vežejo komplement, in precipitin, in nima zaščitnega učinka.
Endotoksin je nekakšna lipopolisaharidna snov (LPS), ki je toplotno obstojna in kemično stabilna in je ni enostavno uničiti. Če je v cepivu določena koncentracija endotoksina, bo to povzročilo hudo vročino in celo smrt po cepljenju, zato je treba vsebnost endotoksina v cepivu čim bolj zmanjšati. Izdaja Kitajske farmakopeje iz leta 2005 (del III) je določila, da kontrolna vrednost kvalificiranega indeksa endotoksina cepiva proti steklini ne sme biti višja od 100 EU/odmerek. S hitrim razvojem tehnologije membranskega ločevanja postaja uporaba tehnologije ultrafiltracijskega membranskega ločevanja za zmanjšanje vsebnosti endotoksina v cepivih vse bolj razširjena v farmacevtski industriji.
Cepivo proti steklini je cepivo proti steklini. Običajno obstajajo tri vrste cepiv proti steklini, vključno s prečiščenim celičnim cepivom Vero, cepivom s človeškimi diploidnimi celicami in cepivom iz primarne celične kulture. Cepivo proti steklini je narejeno z inokulacijo fiksnega virusa virusa stekline v celični matriks po kulturi, žetvi, koncentraciji, inaktivaciji, čiščenju in dodajanju ustreznega stabilizatorja. Glavna naloga cepiva proti steklini je spodbuditi telo k hitremu imunskemu odzivu in tvorbi zaščitnih protiteles proti virusu stekline, da se prepreči okužba, ki jo povzroča virus, in zmanjša tveganje za nastanek bolezni.
Proizvodni proces cepiva igra pomembno vlogo pri zagotavljanju kakovosti cepiva, še posebej je pomembnejša kvantifikacija nekaterih kazalnikov v proizvodnem procesu. V proizvodnem procesu človeškega cepiva proti steklini je tehnologija ultrafiltracijske koncentracije nujno sredstvo za proizvodnjo človeškega cepiva proti steklini. Uporaba ultrafiltracijske membrane z razumno odprtino za ultrafiltracijsko koncentracijo lahko učinkovito odstrani endotoksin in gostiteljske beljakovine ter obdrži antigen RV, kar je ugodno za proizvodnjo cepiva in izboljšanje kakovosti. Relativna molekulska masa molekul RV je 350 kDa ~ 460 kDa in teoretično je RV mogoče popolnoma ujeti z ultrafiltracijsko koncentracijo z uporabo membranske kasete s prestrezno molekulsko maso 100 kDa in 300 kDa. Endotoksin pogosto tvori agregatno strukturo v različnih vodnih raztopinah, zaradi stopnje agregacije je velikost molekule različna. Relativna molekulska masa monomera endotoksina je 10 kDa ~ 20 kDa, relativna molekulska masa njegove polimerizacijske oblike pa je 300 kDa ~ 1000 kDa ali več kot 1000 kDa. Na podlagi razlike v molekulski masi je bil antigen RV v človeškem cepivu proti steklini ohranjen, endotoksin in gostiteljski protein v človeškem cepivu proti steklini pa sta bila odstranjena z ultrafiltracijsko membrano 300 kDa.
V tem poskusu je bila uporabljena ultrafiltracijska membranska kaseta z odprtino 300kDa in površino membrane 0,11 m2 kot zdravljenje z majhnimi vzorci za koncentriranje vmesnih produktov človeškega cepiva proti steklini in pretok membrane, učinkovitost zdravljenja, večkratna koncentracija, prestrezanje antigena, odstranitev endotoksina , in testirali smo odstranitev gostiteljskih beljakovin.
2Materialna metoda
2.1 Eksperimentalni materiali
Sev virusa stekline fiksiran virus CTN-IV; Vero celice; 0.5M natrijev hidroksid; 300kDa ultrafiltracijska membranska kaseta (PES material, 0,11 m² površine membrane).
2.2 Eksperimentalne metode
2.2.1 Priprava raztopine za zbiranje virusov
Zamrznjene celice Vero so bile oživljene v topli vodi pri 37 stopinjah ~ 39 stopinjah, celična suspenzija je bila odvzeta in nato dodana v 199 gojišče, ki je vsebovalo 10% inaktiviranega telečjega seruma. Enotne enoslojne celice smo gojili pri 37 stopinjah. Sev CTN-IV je bil inokuliran z virusom stekline v razmerju 0.1mol/L in gojen pri 37 stopinjah. Po 48 urah smo gojišče zavrgli in dodali 199 gojišče, ki je vsebovalo 0,1 % albumina iz človeške krvi, da smo ohranili kulturo pri 33 stopinjah ~ 35 stopinjah. Poberite strup bolezni enkrat na 3d-5d in združite več tekočin za pobiranje.
2.2.2 Namestitev membranske kasete
Namestite membransko kaseto in povežite ožičenje, kot je prikazano na spodnji sliki.
2.2.3 Pranje z vodo
Zaprite vstopni ventil, povratni ventil in skoznji ventil ter vstavite povratni konec in skoznjo cev v rezervoar za odpadno tekočino. Napolnite sesalni rezervoar z 1 L vode za injekcije.
Odprite vstopne in povratne ventile, zaprite skoznje ventile, odprite črpalko, očistite povratni vod z 10% prostornine prečiščene vode ali vode za injekcije in vzdržujte vstopni tlak pri 0,35 bara (5 psi).
Odprite ventil filtra, zaprite povratni ventil in s preostalo vodo za vbrizgavanje očistite cev filtra, pri čemer vzdržujte TMP na 0,35 bar.
2.2.4 Dezinfekcija
Zaprite vstopni ventil, povratni ventil in prenosni ventil ter vstavite povratni konec in prenosni končni vod v rezervoar za odpadno tekočino. Napolnite sesalni rezervoar z 2 L čistilne raztopine.
Odprite dovodni in povratni ventil, zaprite skoznje ventile, odprite črpalko, očistite povratni vod z 200mL 0,5 M natrijevega hidroksida in vzdržujte vstopni tlak pri 0,35 bara (5 psi) .
Odprite prehodni ventil, zaprite povratni ventil in očistite prehodno cev z 200 ml prostornine čistilne raztopine, pri čemer vzdržujte TMP pri 0,35 bara.
Nato se povratni konec in skoznja cev vstavita v rezervoar za tekočino za ciklično čiščenje. Cikel čiščenja z 1 ~ 1,5-kratno hitrostjo tangencialnega pretoka procesa 30 minut.
Odcedite 0.5 M natrijevega hidroksida in sperite z vodo za injekcije v skladu s 2.2.4 do nevtralnega stanja.
2.2.5 Preskus pretoka vode
V dovodni rezervoar dodajte prečiščeno vodo, izmerite in zabeležite temperaturo vode v dovodnem rezervoarju. Povratni konec vstavite v rezervoar. Zaženite črpalko in prilagodite hitrost črpalke in povratni ventil, da dosežete transmembransko tlačno razliko 0.35 bar (5 psi). Z valjem izmerite in zapišite pretok na koncu v ml/min. Prilagodite hitrost črpalke in povratni ventil, da dobite 1 bar (15 psi) transmembranskega diferenčnega tlaka. Z valjem izmerite in zapišite pretok na koncu v ml/min.
Za standardizacijo vrednosti pretoka vode razdelite izračunano vrednost pretoka vode s transmembransko razliko tlaka in pomnožite korekcijski faktor temperature v naslednji tabeli.
2.2.6 Ultrafiltracijska koncentracija
Vodo sperite iz sistema z vrhom pufra. Krožite 5 minut, da prilagodite pH in ionsko stabilnost sistema. Če je treba temperaturo prilagoditi, nadaljujte s ciklom, dokler temperatura sistema ni stabilna.
Dodajte napajalno tekočino v sesalni rezervoar, nastavite pretok dovoda (npr. 400 LMH) in preizkusite pretok pri različnih vrednostih TMP. Glede na testne podatke so bile krivulje narisane s TMP kot absciso in Flux kot ordinato.
Prehodno cev usmerite v primerno posodo ali odtok, kot so pretočni zbiralni rezervoarji, rezervoarji za odpadne tekočine in procesni odtoki.
Zabeležite začetno težo napajalne tekočine v napajalni posodi, zaženite napajalno črpalko in počasi krožite napajalno tekočino 3 do 4 minute. Recirkulacija lahko pomaga odstraniti preostali zrak na poti pretoka, s čimer se poveča učinkovitost filma.
Odprite prehodni ventil, počasi povečujte hitrost črpalke, dokler ne dosežete optimalnega tangencialnega pretoka, in prilagodite povratni ventil, da dosežete optimalni TMP sistema.
Nato postavite cev v zbiralno posodo, začnite meriti čas, ko tekočina vstopi v posodo, in zabeležite vstopni in povratni tlak v ustreznih intervalih ter zabeležite kakovost tekočine skozi čas na povratnem koncu in skoznjem koncu, da izračunate trenutni Pretok.
Ultrafiltracijska koncentracija vzorca je zaključena, ko se volumen tekočine krme zmanjša na ciljni volumen koncentracije.
2.2.7 Dializa
Postavite sesalno cev, cev za polnjenje in povratno cev v sesalni rezervoar, prenosno cev postavite v zbirno posodo in postavite zbirno posodo na tehtnico, da se očisti.
Odprite povratni ventil, zaženite vstopno črpalko, odprite prehodni ventil, nastavite hitrost črpalke in TMP na ustrezno vrednost. Odprite črpalko za polnjenje, ohranite prostornino tekočine v dovodnem rezervoarju nespremenjeno in začnite dializo enakega volumna. Začnite meriti čas, ko tekočina vstopi v posodo, zabeležite tlak na vstopnem koncu, povratnem koncu in maso tekočine v ustreznem časovnem intervalu ter z izračunom pridobite trenutno stopnjo pretoka.
2.2.8 CIP
Najprej sperite s pufrom, nato sperite z vodo za injekcije (operacija 2.2.3), nato očistite s čistilnim sredstvom (operacija 2.2.4) in na koncu sperite z vodo za injekcije (operacija 2.2.3).
2.2.9 Preskus pretoka vode
Delovanje je naslednje: 2.4.5.
2.2.10 Konzervacija membranske kasete
Kratkotrajno shranjevanje (manj kot ali enako 3 dni), membransko kaseto hranite v vpenjalu in uporabite raztopino za shranjevanje, da krožite 10 do 15 minut, zaprite sistemski ventil, prekinite napajanje črpalke za tekočino in zagotovite ali je rezervoar za dovod tekočine pravilno zaprt.
Če je čas shranjevanja od 3 dni do 1 meseca, odstranite membransko kaseto iz napeljave in jo zaprite v plastično vrečko ali drugo nepredušno posodo. Dodajte približno 50 ml do 100 ml raztopine za shranjevanje v plastično vrečko ali nepredušno posodo in jo zaprite. Lahko pa se potopi neposredno v raztopino za shranjevanje. Naslednja tabela priporoča pogoje shranjevanja.
3 Rezultati in analiza
3.1 Raziskava dejavnikov vpliva na učinkovitost odstranjevanja pirogena
Delovni tlak ultrafiltracije: 15 preskusnih serij je potekalo neprekinjeno. V vsaki seriji je bil filtracijski tlak med ultrafiltracijo vzdrževan pri 5, 10, 15 in 2{{10}}psi, tekočina za zbiranje virusa pa je bila 30-krat koncentrirana in eluirana s pufersko tekočino (10-kratna prostornina) v neprekinjenem toku. Rezultati, kot so prikazani v spodnji tabeli, je bila stopnja odstranitve endotoksina manjša od 87,0 %, stopnja obnovitve antigena je bila stabilna pri 86,0 %, stopnja odstranitve gostiteljskega proteina pa stabilna pri 90,0 %, kar kaže da so različni delovni pritiski imeli majhen vpliv na učinek obnovitve antigena, odstranitev endotoksina in odstranitev gostiteljskega proteina.
Koncentracijsko razmerje ultrafiltracije: 15 preskusnih serij je potekalo neprekinjeno. V vsaki seriji je bila tekočina za zbiranje virusa med ultrafiltracijo koncentrirana 30-krat, 50-krat, 80-krat oziroma 100-krat. Tlak filtracije smo vzdrževali pri 20 psi in pufrsko tekočino (10-kratni volumen) smo eluirali v neprekinjenem toku. Rezultati, kot so prikazani v naslednji tabeli, se je stopnja odstranitve endotoksina gibala od 53,3 % do 86,9 %, stopnja obnovitve antigena je ostala stabilna pri 86,0 %, stopnja odstranitve gostiteljskega proteina je bil stabilen pri 91,0 %. Pri segmentiranem vzorčenju v raztopini za prenos ni bil odkrit noben antigen in v koncentrirani raztopini virusa je ostalo manj kot 10 % gostiteljskega proteina. Koncentracija endotoksina v koncentrirani raztopini virusa se je povečala s povečanjem koncentracijskih časov, stopnja odstranitve endotoksina pa je bila najvišja v koncentriranem vzorcu 80-krat, proizvajalec pa je lahko upošteval tudi 100-kratno koncentracijo, kar ne samo izboljšala učinkovitost proizvodnje in zmanjšala stroške, hkrati pa izpolnila zahteve proizvodnje cepiva.
3.2 Izčrpavanje pretoka membranske kasete in regeneracija čiščenja
Po zdravljenju je bila stopnja obnovitve membranskega pretoka 92,6 %. Prva stopnja obnovitve nove membranske kasete je normalna, glede na trenutne opazovane lastnosti napajalne tekočine, poznejše napovedi drugega in NTH časa bo stopnja obnovitve pretoka membranske kasete blizu podatkov po tej obdelavi in ponavadi stabilni. V 2 urah enkratne uporabe je bila izčrpanost membranske kasete idealna in med celotnim delovanjem je bilo izčrpanih le 10 % membranskega pretoka.
3.2.1 Izčrpavanje pretoka v procesu obdelave membranske kasete
3.2.2 Rezultat čiščenja in regeneracije membranske kasete
O Guidlingu
Guidling Technology je nacionalno visokotehnološko podjetje, ki se osredotoča na biofarmacevtiko, celično kulturo, čiščenje in koncentracijo biomedicine, diagnostiko in industrijske tekočine. Uspešno smo razvili centrifugalne filtrirne naprave, ultrafiltracijske in mikrofiltracijske kasete, virusni filter, sistem TFF, globinski filter, votla vlakna itd., ki v celoti izpolnjujejo scenarije uporabe biofarmacevtskih izdelkov, celične kulture itd. Naše membrane in membranski filtri se pogosto uporabljajo pri koncentraciji, ekstrakciji in ločevanju predfiltracije, mikrofiltracije, ultrafiltracije in nanofiltracije. Naše številne linije izdelkov, od majhnih laboratorijskih filtrov za enkratno uporabo do proizvodnih filtracijskih sistemov, testiranja sterilnosti, fermentacije, celične kulture in več, izpolnjujejo potrebe testiranja in proizvodnje. Guidling Technology se veseli sodelovanja z vami!