Povzetek:

Ta članek pregleduje dva ključna dejavnika, ki ju je treba upoštevati v strategijah čiščenja beljakovin: zahteve glede uporabe nižje in biološke značilnosti samih beljakovin. Članek poudarja, da je kakovostno čiščenje beljakovin temelj za zanesljivost in ponovljivost eksperimentalnih podatkov, zlasti za proizvodnjo rekombinantnih beljakovin. Različni scenariji uporabe imajo posebne zahteve za čistost beljakovin, aktivnost ali vsebnost endotoksina, značilnosti beljakovin pa lahko znatno vplivajo na strategije čiščenja. V skladu s posebnimi primeri članek ponazarja, da bi morali edinstveni proteini sprejeti prilagojene sheme čiščenja. Nazadnje je bil predlagan sistematičen postopek proizvodnje beljakovin (slika 1), ki poudarja nadzor kakovosti polnega procesa od izbire ekspresijskih sistemov, konstrukcijske zasnove do optimizacije čiščenja in priporoča ocenjevanje homogenosti in funkcionalnosti beljakovin z biofizikalnimi tehnikami (kot so Sec-Mals, DSF itd.). Ta članek je namenjen zagotavljanju praktičnih smernic za raziskovalce, ki jim pomagajo oblikovati učinkovite in ponovljive strategije čiščenja, ki temeljijo na značilnostih in zahtevah uporabe ciljnih beljakovin, s čimer se izboljša kakovost in učinkovitost znanstvenih raziskav.

 

Slika 1. Shematski diagram procesa proizvodnje beljakovin

 

Proizvodnja beljakovin z visoko povpraševanje - primeri identifikacije problemov, oblikovanje strategije za ublažitev in ustrezni rezultat

 

1.Nukleinska kislina vezava na beljakovine:

Pri čiščenju beljakovin, ki vežejo nukleinsko kislino, je za odstranitev kontaminacije z nukleinsko kislino potrebno več korakov. Med lizo je treba dodati nukleaze (na primer nukleazo SM (benzonase®) ali DNase ali RNase), vendar ni mogoče popolnoma odstraniti vezanih nukleinskih kislin. Zamenjajte korake odstranjevanja nukleinske kisline, kot so padavine PEI ali streptomicin sulfat, čiščenje heparina ali ionsko izmenjevalno kromatografijo. Prisotnost nukleinskih kislin smo spremljali z razmerjem A26 0 nm/A28 0 nm v celotnem postopku čiščenja. Če je bilo razmerje nižje od 0,6, je to pokazalo, da je bila čistost beljakovin razmeroma visoka, kontaminacija nukleinske kisline pa minimalna. Za beljakovine z močno vezanimi nukleinskimi kislinami jih lahko začasno denaturiramo (na primer obdelano s sečnino) in nato renasiviramo. Ključne točke: Uporabite visokokakovostne reagente, sveže puferje in čiste stebre (pred uporabo čiste z 0,5 m NaOH).

 

2. mišja feritin težka veriga:

Namen izdelave beljakovin prečiščene mišje feritin (MFTH1) je mikroelektronska mikroskopija z visoko ločljivostjo (krio-EM). Vektor Escherichia coli, ki je bil kodiran neoznačen MFTH1, je bil ultrazvočno moten, ne da bi dodal kakršno koli nukleazo. Po ogrevanju pri 7 0 stopnji je bila podvržena padavinam amonijevega sulfata, dializi in velikosti izključitvene kromatografije. Nastali vzorec je pokazal prisotnost velike količine onesnaževal na slikah krioelektronske mikroskopije (slika 2A), ki je bila popolnoma neprimerna za njegovo uporabo. Optimizirajte korake. Med procesom lize celice dodajte SM nukleazo in postopek dialize po padavinah amonijevega sulfata in nato dodajte korak kromatografije anionske izmenjave, da zmanjšate razmerje A26 0 NM/A280Nm od 1,4 do 0,8. Po izključitvi kromatografije velikosti je bilo razmerje med A260NM/A280NM končnega vzorca MFTH1 0,56. Mikroskopske slike SDS-PAGE in krioelektronske mikroskopije (slika 2B) so pokazale, da je bil protein zelo čist, kar kaže, da so bili onesnaževalci učinkovito odstranjeni.

Slika 2 Težka veriga mišjega feritina

 

 

 

3. Človek himernega proteina DSRBEC (DSRBD-EGF-CHIMERA):

DSRBEC nastane z fuzijo dvoverižne RNA vezavne domene (DSRBD) človeške proteinske kinaze R in človeškega epidermalnega rastnega faktorja (HEGF). Ko je DSRBD izražen v Escherichia coli, kaže izjemno visoko sposobnost vezave dsRNA. Po celični lizi bo onesnažena RNA ovirala vezavo rekombinantnih beljakovin na stolpec s fiksnim kovinskim ionskim afinitetnim kromatografijo (IMAC). Konvencionalne metode, kot so padavine PEI ali streptomicin sulfat, obdelava RNaze ali raztopine pufra z visoko soljo, ne morejo odstraniti RNA. Celična liza je bila izvedena z uporabo pufra, ki vsebuje 4M sečnine. Supernatant smo naložili na stolpec iMac in sečnina od 4m do 0 m počasi uporabljamo čez noč (stolpčna renaturacija). Ranaturacijski pufer je bil dodan z imidazolom in eluiran iz stolpca iMac. Končno izpopolnjevanje je bilo izvedeno s filtracijo Superdex 75 gela za pridobitev funkcionalno aktivnega DSRBEC.

 

4. beljakovine, vezane na dvovalentne katione ali druge kofaktorje:

Za beljakovine, ki delujejo z dvovalentnimi kationi, kot so Zn 2+, Fe 2+, cu 2+ ali druge kofaktorje, je ključnega pomena dodajanje specifičnih dvovalentnih kationov (ali drugih kofaktorjev) med izražanjem. Med postopkom čiščenja je potrebna tudi majhna količina istih dvovalentnih kationov (ali drugih kofaktorjev). Vendar pa se je treba izogibati uporabi katerega koli kelacijskega zdravila (na primer EDTA, EGTA) in kelacijskih redukcijskih sredstev (kot sta DTT ali DTE). Pri obravnavi beljakovin, vezanih na dvovalentne katione, je treba za potrditev dejanske prisotnosti dvovalentnih kationov (ali drugih kofaktorjev) v prečiščenem proteinu s spektroskopskimi metodami (kot je atomična absorpcijska spektrofotometrija) uporabiti mešanico zaviralcev proteaze brez kelacijskih sredstev).

 

5. Rekombinantni feridoksin (RFD), ki vsebuje en sam [2Fe ± 2s] grozd iz termofilnih cianobakterij mastigokladus laminosus

Ferridoksin je topni protein železovega žvepla, ki sodeluje v reakcijah prenosa elektronov. Rastlinski feroredoksin nosi en sam [2Fe ± 2s] grozd kot sprejemnik elektronov fotosistema I. Sev Escherichia coli BL21 (DE3) je izrazil rekombinantni RFD protein v mediju TB, ki vsebuje 10mm feCL3 in antibiotiko. Elucija stolpca za zajem IMAC je bila izvedena z uporabo pufra, ki vsebuje 10 mm histidin, da se izogne ​​imidazolu in prepreči uničenje grozda [2FE ± 2s]. Za nadaljnje čiščenje in koncentracijo do 12 mg/ml za presejanje kristalizacije smo uporabili anionsko izmenjavo in izključitveno kromatografijo. V primerjavi z rekombinantno proizvodnjo feroredoksina je naravni feroredoksin, očiščen iz modro-zelenih alg mastigokladus laminosus, med kristalizacijo dosegel večjo ločljivost.

 

6. Beljakovine, ki se uporabljajo kot antigeni

Beljakovine se pogosto uporabljajo kot antigeni za obnovitev ligandov, specifičnih za ciljno specifično. Prva stvar, ki jo je treba upoštevati, je, ali se protein uporablja za in vivo imuniteto za pridobitev običajnega monoklonskega ali poliklonalnega IgG ali za programe, ki vključujejo kamel IgG ali in vitro izbirne procese.

 

6.1 antigeni, ki se uporabljajo za rutinsko proizvodnjo protiteles

Kadar se antigeni uporabljajo za proizvodnjo monoklonskih protiteles IgG, pravilno zlaganje antigena običajno ni potrebno, saj večina monoklonskih protiteles prepozna linearne epitope, na katere struktura antigena ne vpliva močno in celo denaturirani antigeni (na primer vključitveni telesni proteini). Vendar je treba čistost strogo nadzorovati, da se izognemo močnim imunogenim onesnaževalcem, ki posegajo v imunski odziv in povzročijo prevlado neciljnih protiteles.

 

6.2 Pregled knjižnice konjugata

Posebno pozornost je treba nameniti ohranjanju naravne konformacije antigena med obdelavo knjižnice nanobodij, pridobljene z imunizacijo kamel. Za razliko od običajnih protiteles se protitelesa kamele (zlasti nanobodije) ponavadi prepoznavajo strukturne epitope, ki so povezani z njihovo edinstveno konveksno komplementarno strukturo. Podobno mora pri pregledu velikih sintetičnih ali naravnih knjižnic protiteles in vitro antigen vzdrževati strukturo, ki je popolnoma skladna s ciljno uporabo. Ker sam presejalni postopek ni pristranski, če ima antigen napačno znižanje, združevanje ali konformacijsko heterogenost, se lahko prikaže veliko število konjugatov, ki ciljajo na nenaravne epitope.

 

 

 

7. beljakovine, ki vsebujejo medmolekularne ali intramolekularne disulfidne vezi ali prosti cistein

Disulfidne vezi so ključne za stabilizacijo naravne strukture beljakovin. Med čiščenjem, pri čiščenju beljakovin, ki vsebujejo medmolekularne ali intramolekularne disulfidne vezi, je treba preprečiti dodajanje reducirajočih sredstev, da se prepreči konformacijske spremembe beljakovin in s tem spremeni njihove funkcije. Pri beljakovinah, ki vsebujejo prosti cistein, so redukcijska sredstva nepogrešljiva v vseh korakih postopka čiščenja, zlasti med skladiščenjem, da se prepreči nastanek umetnih disulfidnih vezi. Najpogosteje uporabljena reducirajoča sredstva so ditiotreitol (DTT), -MerCaptoethanol (-me) in Tris (2- karboksietil) fosfin hidroklorid (TCEP). Za iMac smole, ki niso združljive z DTT ali TCEP, je priporočljivo uporabiti -me in jih nadomestiti z drugimi reducirajočimi sredstvi v naslednjih korakih.

 

8. rekombinantni fragment protiteles

Čeprav je struktura rekombinantnih fragmentov protiteles (kot so nanobodije) preprostejša od IgG, je njihova funkcija odvisna od pravilne tvorbe disulfidnih vezi. V sistemih bakterijskih ekspresij, tudi pri sprejemanju strategij za optimizacijo, se lahko še vedno pojavljajo napačni ali delno zloženi izdelki, ki obstajajo tako v topnem delu kot v vključenem telesu. Bolj prikrita je, da lahko tudi pravilno zloženi fragmenti protiteles tvorijo topne agregate (koloidna agregacija) skozi hidrofobne plake na površini. Takšne agregate je težko prepoznati v rutinskih funkcionalnih testih (kot je ELISA), ker lahko večvalentna vezava prikrije upad afinitete monomera, vendar lahko njihova prisotnost resno vpliva na aplikacije, ki se zanašajo na velikost majhne molekule (kot je mikroskopija s super ločljivostjo). Zato zanašanje samo na SDS-PAGE ni dovolj za oceno kakovosti vzorca. Za razlikovanje monomerov (glavnih vrhov) od agregatov je treba sprejeti biofizikalne metode, kot je filtracija gela (slika 3) od agregatov (vrhovi izključitve). Ključne kontrolne točke vključujejo: optimizacijo redoks okolja med izražanjem za spodbujanje oblikovanja disulfidne vezi in optimizacijo pogojev skladiščenja po čiščenju, da se prepreči združevanje. Ti ukrepi so ključni za zagotavljanje monodisperznosti in delovanja fragmentov protiteles.

Slika 3. Ločevanje filtracije gela topnih agregatov nanobodij

 

9. Topni fragmenti limfocitnega receptorja LLT1

Rekombinantna ekspresija beljakovin, odvisnih od disulfida (kot je limfocitni receptor LLT1), se pogosto sooča z zložljivimi težavami. Gel filtracija divjega tipa LLT1 je pokazala vrhove združevanja in dimer vrhov (slika 4A), vendar je masna spektrometrija razkrila napačno znižanje, ki ga povzroča neparni cistein v dimerju (slika 4B). V ta namen sta bila zasnovana dva mutanta: ena je odstranila težavo s cisteinom, kar je povzročilo nenaden padec donosa (slika 4A); Po uvedbi neocisteina za rekonstrukcijo konformirane disulfidne vezi mu mutant ni imel le visokega donosa in dobrega stabilnosti, ampak je lahko tudi kristaliziral (slika 4C), 3D struktura pa je potrdila, da je mutant tvoril pravilno disulfidno vez in vzdrževal naravno zlaganje. Ta primer kaže, da je z racionalno oblikovanjem konformnih disulfidnih vezi v kombinaciji z analizo filtracije gela in masno spektrometrijo mogoče učinkovito rešiti problem z zlaganjem rekombinantnih beljakovin in dobiti funkcionalne beljakovine s stabilnimi strukturami in visokimi izkoristki.

Slika 4. Rekonstrukcija disulfidne vezi izboljša zložljivo in donos topne LLT1

 

 

 

10. enostavno združene beljakovine

Čiščenje rekombinantnih beljakovin se pogosto sooča s problemom agregacije, njena tvorba pa sledi mehanizmu "nukleacijske rasti"-majhna količina topnih agregatov najprej se oblikuje in nato sproži obsežno netopno agregacijo. To address this challenge, multi-level strategies need to be adopted: At the expression stage, this can be achieved by optimizing the strain, reducing the culture temperature, using modified culture media or different solubilizing fusion proteins, and replacing expression systems (insect/mammalian cells), etc. During the purification stage, rapid operation (in a 4 degree C environment) is required to avoid excessive protein concentration, and a "rapid purification strategy" (such as direct connection of IMac do sec) je treba sprejeti, da se takoj odstranijo skupna jedra. Na splošno je treba pri presejalnih pufernih rešitvah upoštevati dejavnike, kot so sestava komponent, pH vrednost, disociacijsko sredstvo ali solubilizator (slika 5). S fino optimizacijo ortogonalnega odkrivanja (kot so SEC, CD, LS, DSF in temperaturni premik na podlagi fluorescenčne toplote itd.) Smo določili kakovost beljakovin in najprimernejšo puferno raztopino.

Slika 5. Strategije za lajšanje združevanja beljakovin

 

11. Kristalizacija človeške CLK1 kinaze (kako pridobiti ponovljive serije)

Za pridobitev homogene nefosforilirane CLK1 kinaze za študije kristalizacije je bila sprejeta večstranska skupna shema. Prvič, v Escherichia coli je bil sočasno izražen z λ -fosfatazo, da bi odpravil heterogenost avtofosforilacije. Čeprav se je donos zmanjšal, je bila zagotovljena popolna defosforilacija. Po zajetju IMAC -a je bil eluent dopolnjen s stabilizatorji (50 mm arginina, 50 mm glutaminsko kislino in 10 mm DTT), da se prepreči združevanje, koncentrirano, njegovo oznako pa je bila odstranjena s TEV prebavo. Nato smo pravilni oligomer ločili s SEC (ki vsebuje 5% glicerola in -Me). Končni ključni korak izmenjave aniona razlikuje med kristalnimi (nefosforiliranimi) in nekristalnimi (delno fosforiliranimi) skupinami CLK1. Še posebej je treba opozoriti, da način lize celic znatno vpliva na stabilnost beljakovin-visokotlačna in visokotemperaturna metoda vodi do nepovratnega združevanja CLK1, kar poudarja pomen blagega zdravljenja za pripravo kinaze.

 

 

 

12. Proizvajajte galektin -1 s stabilno sposobnostjo vezave ligandov

Za pripravo funkcionalnega galektina -1 za študije vezave ligandov so bile primerjane strategije izražanja in čiščenja štirih konstruktov (neoznačenih in njegovih označenih divjega galektina -1, neoznačenega in njegovega označenega cisteina, ki ne vsebuje cisteina, mutiranega galektina {6}}). Ključne ugotovitve kažejo, da lahko čiščenje laktozne afinitetne kromatografije učinkovito zaslon za pravilno zložene beljakovine, vendar ga je treba kombinirati s temeljito dializo (HEPES pufer), da se popolnoma odstrani laktoza z vezivnega mesta in obnovi aktivnost CRD. Galectin divjega tipa -1 je nagnjen k oksidaciji in inaktivaciji, njegova stabilnost pa ostane omejena tudi v prisotnosti reducirajočih sredstev (slika 6). Vendar mutant brez cisteina znatno poveča dolgoročno stabilnost, hkrati pa ohranja primerljivo aktivnost aglutinacije in toplotno stabilnost (preverjeno z nanods, ITC itd.) Z odpravo odvisnosti disulfidne vezi.

Slika 6. Hidrodinamična karakterizacija rekombinantnega galektina -1 razkriva njegovo nestabilnost

 

13. Odstranjevanje endotoksina

Metoda odstranjevanja endotoksina temelji na afinitetni kromatografiji, vključno s pozitivno nabito kromatografijo (anionska izmenjava), uporabo polikacijskih ligandov (na primer poli-l-lizin (PLL), imobilizirani poliamin (polimiksin B)) in dodajanjem površinsko aktivnega Tritona X {2}}. Med postopkom čiščenja bodite pozorni na pripravo varovalne raztopine z vodo brez LPS in uporabite nove stolpce ali stolpce, ki so bili uporabljeni le pri drugih čistih brez LPS. Za kontaminacijo endotoksina lahko kromatografski sistem črpalke/tekočine inkubiramo čez noč v 0. 5M NaOH ali 4 ure v 1. 0 m NaOH. Končna količina LPS v vzorcu je bila ovrednotena s pomočjo limulus amebocitnega lizat reagenta (LAL) in preverjena, ali je pod mejo, ki je potrebna za določeno uporabo.

 

14. proteinski kompleks

Ekspresijo in čiščenje beljakovinskih kompleksov je treba optimizirati glede na specifične pogoje. Izzivi vključujejo nestabilnost ali napako podenot. Vsako podenoto je mogoče izraziti neodvisno in sestaviti in vitro ali koeksprimirati, da tvori funkcionalne beljakovinske komplekse. Konstrukcijsko zasnovo je treba skrbno uvesti s čiščenjem ali nalepkami za odkrivanje, da se izognemo poseganju v montažo, zlasti kadar so zapletene informacije omejene in so potrebne več optimizacij. Med postopkom čiščenja je treba oceniti celovitost in stabilnost kompleksa. Metode vključujejo SDS-PAGE (odkrivanje podenote), SEC (homogenost), SEC-Mals (analiza molarne mase), masno fotometrijo ali naravno masno spektrometrijo (masno preverjanje). Treba je opozoriti, da se lahko kompleks loči pri nizkih koncentracijah. V tem času je treba optimizirati kromatografsko metodo ali pufer (na primer s toplotnim odmikom ali pogoji presejanja DSF). Poleg tega lahko zmanjšanje korakov čiščenja prepreči izgubo šibkih interakcijskih podenot in uravnoteži učinkovitost čiščenja in celovitost kompleksa.

 

 

 

15. Čiščenje kompleksov proti antigenu-protitelesom

Protitelesi-antigenski kompleksi so značilni primeri beljakovinskih kompleksov. Njihova sokristalizacija lahko razkrije vezavne vzorce in vodi optimizacijo inženiringa protiteles. Tradicionalne metode zahtevajo ločeno čiščenje antigenov in protiteles, nato pa jih mešajo. Vendar pa so nedavne študije pokazale, da so strategije koekspresije in sočasnosti učinkovitejše. Za pridobitev kompleksa je potrebno samo eno čiščenje in hkrati lahko nestabilne antigene stabiliziramo s protitelesi in dosežemo celo ekspresijo brez oznak. V tej posebni situaciji sta SDS-PAGE in GEL filtracija (SEC) običajno zadostna za oceno čistosti in kakovosti kompleksa.

 

Povzetek

Čiščenje beljakovin je temeljna tehnologija v znanstvenih raziskavah. Proizvodnja beljakovin v akademskem obsegu ponavadi sledi standardnim strategijam in lahko proizvaja miligramsko na ravni, topne beljakovine, ki se pogosto uporabljajo v strukturni biologiji, biokemiji in funkcionalnih raziskavah. Vendar pa posebne zahteve uporabe na nižji stopnji (na primer potreba po endotoksinu v poskusih na živalih in brez kontaminacije nukleaze v raziskavah nukleinske kisline) ali inherentne značilnosti beljakovin (na primer enostavne agregacije, ki vsebujejo disulfidne vezi ali visoko afiniteto nukleinske kisline) pogosto zahtevajo prilagojene rešitve. Ta pregled kot odgovor na te posebne okoliščine predlaga rafinirane strategije, ki segajo od izbire ekspresijskih sistemov, zasnove konstruktov (optimizacija nalepk in meja domene) do procesa čiščenja in uvaja nadzor kakovosti (na primer SEC, SDS-PAGE, odkrivanje dejavnosti itd.) Pri ključnih korakih. Nekatere aplikacije zahtevajo tudi dodatno analizo (na primer odkrivanje endotoksina in določanje ostankov nukleinske kisline), podobno kot koncept "zagotavljanja kakovosti" (QA) v biofarmacevtski industriji, to je za preprečevanje napak s sistematičnimi procesi. S formuliranjem smernic za nadzor kakovosti in razjasnitvijo posebnih standardov za beljakovinske reagente, ki se uporabljajo v znanstvenih raziskavah, je cilj vzpostaviti bolj stroge norme čiščenja beljakovin za akademske laboratorije, izboljšati zanesljivost in ponovljivost eksperimentalnih podatkov ter premostiti vrzel med osnovnimi raziskavami in industrijskimi standardi.

 

Doi: 10.1186/s 12934-022-01778-5