Postopek koncentriranja ultrafiltracije/diafiltracije: kako učinkovito preprečiti prepustnost in izgubo ciljnih beljakovin

Postopek koncentracije ultrafiltracije/diafiltracije na nižji stopnji: Kako učinkovito preprečiti prepustnost in izgubo ciljnih beljakovin

V nadaljnjih postopkih čiščenja za rekombinantne beljakovine, krvne produkte in druga biološka zdravila se ultrafiltracija/diafiltracija (UF/DF) uporablja za koncentracijo surovine, izmenjavo pufra ter odstranjevanje soli in majhnih-molekulskih nečistoč. Ločevanje se doseže na podlagi membranskega sejanja: velike molekule, kot so monoklonska protitelesa (mAbs), zadrži membrana, medtem ko soli, endotoksini, prosti proteini gostiteljskih celic (HCP) in druge nečistoče majhnih -molekul preidejo skozi membrano in se odstranijo v permeatu. Med povečanjem-postopka lahko hitro pride do ciljne izgube beljakovin skozi membrano, kar neposredno zmanjša donos in poveča stroške serije. V nekaterih delovnih pogojih se lahko v permeatu odkrije beljakovina, kar zahteva hitro določitev, ali so iztekle komponente nedotaknjena ciljna mAb, razgrajeni/fragmentirani agregati ali proteini gostiteljskih celic. Ta članek je razdeljen na dva glavna dela: pregleduje tradicionalne-pristope nadzora procesov in v kombinaciji z načrtovanjem poskusov (DOE) vzpostavlja robustno procesno okno, podprto z več analitičnimi metodami za določanje identitete beljakovin, odkritih v permeatu.

 

 

I. Ključni vzroki za prepustnost ciljnega proteina skozi membrano med UF/DF

1. Prekomerni transmembranski tlak (TMP)
Ko je razlika v tlaku čez membrano previsoka, se upor topila poveča, kar potisne nekaj monomernega proteina v permeat. Med-povečanjem obsega dovodni rezervoar vsebuje večjo prostornino materiala in nihanja tlaka v cevovodih so izrazitejša, zaradi česar je prehodni nadtlak verjetnejši kot v laboratorijskem merilu.

2. Neustrezen tangencialni pretok
Če je pretok prenizek, se na površini membrane oblikuje gosta koncentracijska-polarizacijska plast in lokalna koncentracija beljakovin lahko preseže prag tolerance membrane. Če je pretok previsok, lahko strižna napetost povzroči strukturno cepitev mAb, pri čemer nastanejo manjši proteinski fragmenti, ki lahko prosto prehajajo skozi membranske pore.

3. Previsoka koncentracija beljakovin v surovini
Ko je koncentracija beljakovin v krmi previsoka, se beljakovine kopičijo na površini membrane in nekaj monomernih beljakovin se lahko prenese v permeat. To je pogosta težava pri-veliki proizvodnji.

4. pH ali prevodnost zunaj območja postopka
Spremembe v značilnostih naboja proteina lahko zmanjšajo njegov hidratacijski polmer in navidezno velikost delcev, kar povzroči nenormalno prepustnost membrane.

5. Staranje membranske kasete, visok difuzijski tok ali nezadostno pred-kondicioniranje
Fizične napake v membranski kaseti lahko neposredno povzročijo uhajanje beljakovin in predstavljajo tveganje, -povezano z opremo. Ponavljajoče CIP z močno alkalnimi raztopinami lahko postopoma poškoduje polietersulfonski (PES) membranski material.

6. Prevelik diafiltracijski volumen
Med dolgotrajno diafiltracijo lahko neprekinjeno izpiranje s topilom postopoma odnese majhne količine monomernega proteina.

 

II. Tradicionalni praktični ukrepi za preprečevanje prepustnosti in izgube ciljnih beljakovin

(A) Nadzor parametrov procesa

1. Nadzor transmembranskega tlaka (TMP)
Določite zgornjo opozorilno mejo tlaka in vzpostavite alarme za blokiranje, da preprečite prehodne visoko{0}}tlačne vplive na plast membrane. Po določitvi osnovnih parametrov v majhnem obsegu zmanjšajte varen obratovalni tlak med -razširjeno proizvodnjo in rezervirajte ustrezno območje tolerance postopka.

2. Optimizirajte prečni pretok
Vzpostavite stabilno mejno plast in zmanjšajte polarizacijo koncentracije na površini membrane s pomočjo pretoka, s čimer zmanjšate kopičenje beljakovin na površini membrane pri izvoru.

3. Omejite končno koncentracijo za koncentracijo
Določite mejno koncentracijo na podlagi fizikalno-kemijskih lastnosti beljakovin in se izogibajte čezmerni koncentraciji krme. Za mAbs rutinska končna koncentracija na splošno ne presega 50 mg/mL; pri nekaterih mAbs,-nagnjenih k agregaciji, je treba koncentracijo dodatno zmanjšati.

4. Kontrolirajte pH in prevodnost krme
Ohranjajte stabilno hidrirano velikost delcev beljakovine in se izogibajte molekularnemu krčenju zaradi motenj kislinsko/bazične ali ionske -motnje.

(B) Oprema in kontrole delovanja

1. Pred vsako serijo izvedite testiranje celovitosti membranske kasete
Pred proizvodnjo vsake serije izvedite-test s točko mehurčkov, da prepoznate zlomljena membranska vlakna. Poškodovane membranske kasete je treba takoj zavreči, da preprečite neprekinjeno uhajanje beljakovin.

2. Standardizirajte postopek CIP čiščenja
Nadzorujte koncentracijo NaOH in kontaktni čas. Po močno alkalnem čiščenju popolnoma uravnotežite membranski material, da zmanjšate tveganje deformacije membranskih por.

3. Uporabite stopenjsko diafiltracijo
Uporabite veliko{0}}volumensko izmenjavo medpomnilnika v zgodnji fazi, da odstranite soli, in upočasnite pretok diafiltracije, ko se končna točka približuje, da zmanjšate vlečenje in izgubo beljakovin.

 

III. Vzpostavitev prostora za načrtovanje procesa prek DOE (QbD karakterizacija procesa; velja za oddajo IND)

1. Preverjanje dejavnikov
Pregledajte pet ključnih procesnih parametrov UF/DF (P): transmembranski tlak, hitrost dovodnega toka, začetno koncentracijo beljakovin, pH dovoda in delovno temperaturo.
Spremenljivke odziva: zadržani izkoristek, vsebnost beljakovin v permeatu, pretok skozi membrano in odstotek agregatov z visoko-molekularno-mato.

Z analizo pomembnosti določite ključne dejavnike, ki prispevajo k uhajanju beljakovin.

2. Modeliranje odzivne površine
Izberite štiri parametre z največjim pomenom, da sestavite odzivno površino in analizirate interakcije med parametri. V številnih delovnih pogojih lahko en sam parameter ostane znotraj svojega kvalificiranega območja, medtem ko lahko kombinacija dveh parametrov povzroči prepustnost beljakovin. Takšnih interakcijskih učinkov ni mogoče prepoznati s tradicionalnimi-faktorji---poskusov. Na podlagi modela definirajte operativni prostor oblikovanja. Dokler procesni parametri ostanejo znotraj tega območja, je mogoče zagotoviti učinkovito zadrževanje beljakovin, medtem ko se nečistoče odstranijo z diafiltracijo.

3. Izziv v -najslabšem primeru (potreben za karakterizacijo procesa)
Izberite procesne parametre na skrajnih mejah delovanja, da simulirate variabilnost proizvodnje: največjo TMP, najmanjšo hitrost pretoka in zgornjo-mejno koncentracijo beljakovin. Prepričajte se, da tudi v ekstremnih pogojih delovanja ne pride do velike-izgube ciljnih beljakovin, s čimer izpolnjujete zahteve pregleda CMC.

 

IV. Več analiznih metod za identifikacijo proteinov, odkritih v permeatu, in razlikovanje ciljnih mAb, degradacijskih fragmentov in HCP

Na podlagi analitične učinkovitosti, stroškov in scenarijev predložitve zakonodaje lahko metode razdelimo v dve kategoriji: hitro presejanje in potrditveno testiranje. Hitre metode bi morale imeti prednost pri rutinskem spremljanju procesa; kadar pride do nenormalnih odstopanj, je treba uporabiti natančne metode identifikacije.

1. UV spektrofotometrija (hiter spletni pregled; zaželeno za rutinsko spremljanje-tal v trgovinah)
Zberite permeat in izmerite njegovo absorbanco A280. To lahko samo ugotovi, ali je beljakovina prisotna v permeatu, in ne more razlikovati beljakovinskih vrst. Uporablja se predvsem za rutinsko spremljanje procesov. Stalno naraščajoča vrednost A280 kaže na poslabšanje uhajanja beljakovin in zahteva takojšnjo prekinitev diafiltracije in preiskavo procesa.

2. Elektroforeza SDS-PAGE (najpogosteje uporabljena metoda kvalitativne identifikacije)
Uporabite redukcijsko in ne{0}}reducirajočo elektroforezo in primerjajte položaje trakov s položaji ciljnega mAb v surovini:
1) Če je položaj pasu popolnoma skladen s ciljnim mAb, je nepoškodovano mAb prodrlo skozi membrano.
2) Če se pojavijo trakovi z nižjo-molekularno- maso, je bil protein hidrolitično razcepljen, pri čemer so nastali fragmenti mAb.
3) Če so pasovi razpršeni z več različnimi trakovi, je večina proteinov gostiteljskih celic (HCP) iz gostiteljskih celic E. coli/CHO in ne ciljni produkt.

3. Visoko{1}}zmogljiva-ekskluzijska kromatografija (HPSEC)
Ločite komponente glede na velikost molekule in primerjajte njihove elucijske čase s tistimi v kromatogramu surovine:
- Glavni vrh z enakim retencijskim časom kot mAb označuje nedotaknjen ciljni protein.
- Vrh, ki se prej eluira, kaže na agregate/fragmente z visoko{1}}molekularno- maso.
- Vrh, ki se eluira pozneje, kaže na nizko{1}}molekularne-razgradne fragmente.
- Odsotnost značilnega glavnega vrha kaže na beljakovine nečistoč HCP.
Ta metoda lahko zagotovi kvantitativne podatke in se lahko vključi v poročila o preiskavi odstopanja od procesa; je visoko sprejet v materialih za klinično predložitev.

4. Komplet za testiranje beljakovin gostiteljske-celične celice HCP ELISA
Če je v permeatu zaznana beljakovina, je rezultat ELISA povišan in HPSEC ne pokaže značilnega vrha mAb, je mogoče ugotoviti, da je iztekel material v bistvu beljakovine gostiteljske -celice CHO. To kaže na nepopolno odstranitev nečistoč med čiščenjem navzgor; nečistoče se med fazo UF/DF izpirajo in ne predstavljajo izgube izdelka.

5. Preverjanje afinitetne kromatografije (proteinska kromatografija)
Protein A se specifično veže na regijo Fc mAbs. Vzorec permeata naložite na kolono: pojav značilnega elucijskega vrha kaže na prisotnost nedotaknjenega ciljnega protitelesa; odsotnost elucijskega vrha dokazuje, da so vsi proteini v permeatu nečistoče.

6. Masna spektrometrija (LC-MS) (-globinska sledljivost; uporablja se za preiskavo večjih procesnih odstopanj)
LC-MS lahko neposredno analizira zaporedje aminokislin in natančno določi izvor proteina. Uporablja se predvsem za preiskavo težkih ali nenavadnih odstopanj in se ne uporablja kot rutina pri-kontrolnem testu procesa.

V. Korektivni ukrepi, ki ustrezajo različnim analitskim rezultatom

1. V permeatu odkrito nedotaknjeno ciljno mAb
Zmanjšajte transmembranski tlak in končno koncentracijo za koncentracijo; zožiti območje delovanja procesa na podlagi rezultatov DOE; in preverite celovitost membranske kasete.

2. Fragmenti razgradnje protiteles, odkriti v permeatu
Raziščite strižno napetost v celotnem procesu in skrajne vrednosti pH; optimizirati predhodni korak inaktivacije virusa, da se zmanjša cepitev beljakovin.

3. V permeatu zaznane le beljakovine nečistoč HCP
Prilagajanje parametrov UF/DF ni potrebno. Izsledite težavo nazaj do prejšnjih korakov kromatografije in izboljšajte odstranjevanje nečistoč med afinitetno in ionsko-izmenjevalno kromatografijo.

 

VI. Povzetek

Da bi preprečili uhajanje beljakovin med UF/DF, se tradicionalni nadzor postopka opira na zgodovinske izkušnje za definiranje parametrov posameznih točk, ki lahko ustrezno obravnavajo le stabilno proizvodnjo v majhnem- obsegu. Za zagotovitev stabilnega delovanja med postopnim-širenjem procesa je treba uporabiti karakterizacijo procesa na podlagi DOE-za vzpostavitev prostora načrtovanja procesa z zadostno toleranco. Intervalno-nadzor parametrov lahko kompenzira variabilnost proizvodnje. Ko je beljakovina zaznana v permeatu, lahko preprost sistem UV-zaznavanja zagotovi začetno opozorilo, ki mu sledi elektroforeza, HPSEC in ELISA za sledljivost in identifikacijo. To omogoča natančno razlikovanje med ciljnim produktom in nečistočami-celice gostitelja, kar omogoča ciljno preiskavo vzroka-in korektivne ukrepe. To je tudi standardizirana raziskovalna komponenta, ki je trenutno vključena v dokumentacijo CMC za projekte mAb.