Literatura delitev|Se poslovite od zapletenega čiščenja? Nova metoda TFF + površinsko aktivne snovi izboljša učinkovitost in zmanjšuje stroške v proizvodnji vektorja AAV

Genska terapija se hitro razvija, vendar visoki stroški ostajajo glavna ovira, ki preprečuje širši dostop bolnikov. Med ključnimi gonilniki tega stroškov je kompleksen proizvodni proces adeno - povezanih virusnih vektorjev (AAV). Študija, objavljena v biotehnologiji in bioinženirstvu, je razvila novo metodo čiščenja, ki združuje tangencialno filtracijo (TFF) s površinsko aktivnimi snovmi, ki obljublja poenostavitev procesa čiščenja AAV in zmanjša stroške. Poglejmo to raziskavo, ki jo vodi ekipa z univerze v Tokiu.

 

1. raziskovalno ozadje: izzivi in ​​trenutno stanje čiščenja AAV

Vektorji AAV so v genski terapiji postala orodja za "zvezdo" zaradi svoje visoke varnosti, nizke imunogenosti, sposobnosti okužbe tako delitve kot non - delitvenih celic in zmogljivosti za dolgo - ekspresija genov. Vendar je njihov proizvodni postopek zapleten, zlasti koraki čiščenja na nižji stopnji, ki običajno vključujejo več krogov centrifugiranja in kromatografije. Te metode so čas - porabo, delo - intenzivne, težko obsežne in drage.

V laboratorijskem obsegu se čiščenje pogosto opira na cezijev klorid ali ultracentrifugiranje gostote jodiksanola, ki je izziv za obseg industrijske proizvodnje. Affinitetna kromatografija se vse pogosteje uporablja, vendar lahko nizki pH elution pogoji, ki jih potrebuje, poslabša virusno infektivnost. Zato je razvoj preproste, učinkovite, nežne in razširljive metode čiščenja AAV ključnega pomena.

Tangencialna filtracija pretoka (TFF) je velikost ločevanja na osnovi -, ki se običajno uporablja za koncentracijo in pufer - izmenjava bioproduktov. Vendar ima običajni TFF omejeno sposobnost odstranjevanja nečistoč, kot so beljakovine gostiteljske celice (HCP) in DNK med čiščenjem AAV, kar pogosto pušča beljakovinske agregate za seboj.

 

2. inovativni pristop: TFF v kombinaciji s površinsko aktivnimi snovmi za učinkovito čiščenje

Da bi premagali omejitve tradicionalnega TFF, so raziskovalci Rimi Miyaoka, Yuji Tsunekawa in sodelavci na Tokijski univerzi zasnovali pametno strategijo: z uporabo površinsko aktivnih snovi za zaviranje združevanja in interakcije nečistoč beljakovin, ki jim omogočajo, da se prehajajo skozi ultrafiltracijsko membrane (500 kda molcularno (500 kda molcular) velikost).

Testirali so tri vrste površinsko aktivnih snovi:

• Non - ionic:Octil glukozid
• Anionska:Natrijev deoksiholat
• Zwitterionic:Chaps

Študija je pokazala, da je uporaba ne - ionske površinsko aktivne snovi ne učinkovita. Tako anionski natrijev deoksiholat kot zwitterionski kape so znatno povečali odstranjevanje preostalih beljakovin in so ciljali na različne beljakovinske populacije. Konec koncev je združevanje 0,5% natrijevega deoksiholata z 1% Chaps prineslo izjemne rezultate, kar je skoraj v celoti odpravilo preostale gostiteljske beljakovine. SDS - Analiza strani je pokazala samo tri prozorne aav kapsidne proteinske pasove (VP1/VP2/vp3).

 

Slika 1. postopek čiščenja TFF brez površinsko aktivnih snovi;(a) SDS - strani gel elektroforeza; (b) Prenosna elektronska mikroskopija (TEM)

 

Slika 1. postopek čiščenja TFF s površinsko aktivnimi snovmi;(a) SDS - strani gel elektroforeza; (b) Prenosna elektronska mikroskopija (TEM)

 

3. Rezultati raziskav: visoka čistost, aktivnost in varnost

1. Učinkovito odstranjevanje nečistoč:Nova metoda je dosegla 99,98% odstranjevanje HCP in 95% odstranitev DNK, pri čemer je čistost primerljiva z ali preseganje afinitetne kromatografije.
2. Izboljšana infektivnost:In vitro poskusi so pokazali, da so vektorji AAV1 očiščeni s to metodo okužene celice HEK293 učinkoviteje kot tiste, ki jih očisti afinitetna kromatografija (24,9% v primerjavi z 20,8%), kar kaže na boljše ohranjanje virusne bioaktivnosti.
3. Dobra in vivo varnost:Po lokalni injiciranju očiščenih vektorjev AAV1 v mišje skeletne mišice mišje vnetja ali poškodbe tkiva ni bilo opaziti po dveh tednih, kar kaže na dobro varnost in vivo.
4. Široka uporabnost serotipa:Metoda je uspešno očistila več serotipov -, vključno z AAV1, AAV5, AAV8 in AAV9-od supernatantov celične kulture. Vendar pa je za AAV2, ki v glavnem obstaja v celičnih lizatih z veliko obremenitvijo nečistoč, potrebna nadaljnja optimizacija.

 

4. Povzetek in obeti

Ta študija je razvila preprost, hiter (1,5 ure), učinkovit in razširljiv nov postopek čiščenja AAV. S kombiniranjem natrijevega deoksiholata in predelke je uspešno obravnaval izziv preostalega združevanja beljakovin med čiščenjem TFF.

Prednosti metode vključujejo:

• Izogibanje ostrim nizkim pH pogojem, boljše ohranjanje virusne aktivnosti
• Zmanjšanje korakov kromatografije, poenostavitev delovnega toka in prihranek časa in stroškov
• Preprosto razširljivo, primerno za industrijsko veliko - proizvodnjo lestvice
• Zagotavljanje nove strategije za čiščenje drugih biomakromolekul, kot so eksosomi, drugi virusi in rekombinantna protitelesa

Trenutne omejitve vključujejo suboptimalno obnovitev virusa in nezmožnost ločevanja praznih kapsidov od polnih virusnih delcev, kar kaže na to, da je njegova najboljša uporaba kot prvi - zajem koraka v več - delovniku za čiščenje.

Za zaključek ta raziskava ponuja privlačno novo možnost za nižjo proizvodnjo vektorja AAV in lahko znatno zmanjša stroške zdravil za gensko terapijo, kar olajša njihovo širšo uporabo.