Osnovna načela in potek dela sinteze peptidov v trdni-fazi (SPPS)

Sinteza peptidov v trdni{0}}fazi (SPPS)je metoda za sintezo peptidov na trdnem nosilcu. Glavne strategije SPPS vključujejoMetoda BocinFmoc metoda. Sinteza peptidov je ponavljajoč se proces zaporednega dodajanja aminokislin in se običajno izvaja izC{0}}konec (karboksilni konec)doN-konec (amino konec). Prvič, karboksilna skupina prve aminokisline ciljnega peptida je kovalentno vezana na trdno podlago (smolo). Z uporabo amino skupine te aminokisline kot izhodiščne točke se N-terminalna zaščitna skupina odstrani in rastoča peptidna veriga se podaljša z reakcijo s presežkom aktivirane druge aminokisline. Ta cikel-sklopka → pranje → odstranitev zaščite → nevtralizacija in pranje → naslednja sklopka- se ponavlja, dokler ni dosežena želena dolžina peptida. Končno se peptidna veriga odcepi od smole in prečisti, da dobimo ciljni peptid. Ko je -amino skupina zaščitena zBoc (terc-butiloksikarbonil), metoda se imenujeBoc-temeljena sinteza peptidov v trdni-fazi. Ko je -amino skupina zaščitena zFmoc (9-fluorenilmetiloksikarbonil), je znan kotSinteza peptidov v trdni-fazi na osnovi Fmoc-.

 

Sinteza peptidov v trdni-fazi na osnovi Boc-(metoda Boc)

VMetoda Boc, Boc skupine, odstranljive s trifluoroocetno kislino (TFA)se uporabljajo za zaščito -amino skupin, medtem kozaščitne skupine benzil-tipase uporabljajo za stranske verige. Med sintezo je Boc-zaščitena -aminokislina najprej kovalentno povezana s smolo. Boc skupino nato odstranimo s TFA in nastali prosti amino konec nevtraliziramo s trietilaminom. Naslednja aminokislina se aktivira z uporaboDCC (dicikloheksilkarbodiimid)in spojeni za podaljšanje peptidne verige. Po končanem sestavljanju se ciljni peptid odcepi od smole z uporabo močne kisline, običajnobrezvodni vodikov fluorid (HF)oztrifluorometansulfonska kislina (TFMSA)Pri sintezni metodi Boc so potrebne ponavljajoče se kislinske obdelave za odstranitev zaščitnih skupin pred vsako stopnjo pripajanja. To lahko povzroči številne stranske reakcije, kot je prezgodnja cepitev peptida iz smole in nestabilnost stranskih verig aminokislin v kislih pogojih, kar ima za posledico neželene stranske reakcije.

 

Sinteza peptidov v trdni-fazi na osnovi Fmoc-(metoda Fmoc)

noter1978, Meienhofer in Athertonrazvili strategijo sinteze peptidov z uporaboFmoc (9-fluorenilmetiloksikarbonil)kot -amino zaščitna skupina, znana kotFmoc metoda. Pri tem pristopu je -amino skupina zaščitena zbazno-labilen Fmoc, medtem ko so stranske verige zaščitene zkislinsko-labilne zaščitne skupine-tipa BocGlavna prednost Fmoc kot amino-zaščitne skupine je njegovastabilnost v kislih pogojih; nanjo ne vpliva obdelava z reagenti kot nprtrifluoroocetna kislina (TFA)in ga je mogoče selektivno odstraniti z uporaboblaga osnova. Hkrati so zaščitne skupine stranske{1}}verige, kot je Boc, stabilne v bazičnih pogojih in se odstranijo pri kisli obdelavi. Končno se peptid kvantitativno odcepi od smole zTFA/diklorometan (DCM), izogibanje uporabi močnih kislin in s tem izboljšanje varnosti in združljivosti z rutinsko sintezo peptidov.

 

Zgodovina razvoja sinteze peptidov v trdni-fazi (SPPS)

1. Temeljna stopnja (začetek 20. stoletja do 1963)

noter1902, Emil Fischerje prvi raziskoval sintezo peptidov, vendar je bil napredek počasen zaradi tehničnih omejitev. Uporabljene zgodnje sintezebenzoilne in acetilne zaščitne skupine, ki jih je bilo težko odstraniti pogosto vodile vcepitev peptidne verige.

noter1932, Max Bergmannin -sodelavci so predstavilibenziloksikarbonilna (Z) skupinakot -amino zaščitna skupina. To skupino bi lahko odstranili podkatalitsko hidrogeniranje ali kisle pogoje, ki zagotavlja zanesljivejše orodje za sintezo peptidov in postavlja temelje za razvoj sinteze peptidov v trdni-fazi v šestdesetih letih prejšnjega stoletja.

Med1950s, so znanstveniki uspešno sintetizirali različnebiološko aktivni peptidi, kot nproksitocin in insulin. Ti dosežki so dodatno napredovali v kemiji peptidov in postavili temelje za nastanek sinteze peptidov v trdni-fazi.

 

2. Pionirski oder (1963)

noter1963, Robert B. Merrifieldpredlagalmetoda sinteze peptidov v trdni{0}}fazi (SPPS)., v katerem jeC-terminalna aminokislinaje zasidran na smolni nosilec in peptidna veriga se podaljša skozi ponavljajoče se cikleodstranitev zaščite in spajanje. Ta pristop je močno poenostavil proces sinteze peptidov in postalprednostna metodaza sestavljanje peptidov.

Uporabljeno MerrifieldBoc (terc-butiloksikarbonil)za zaščito -amino skupine. Do poznih šestdesetih let prejšnjega stoletja je razvil tudiprvi popolnoma avtomatiziran peptidni sintetizatorin uspešno sintetiziranbiološke beljakovinekot nprribonukleaza (124 aminokislin). Za te prelomne dosežke je Merrifield prejel nagradoNobelova nagrada za kemijo leta 1984.

 

3. Faza tehnoloških inovacij (1972)

noter1972, Lou Carpinorazvili9-fluorenilmetiloksikarbonil (Fmoc) zaščitna skupina, ki je lahkonežno odstraniti pod osnovnimi pogoji, zmanjšanje stranskih reakcij. Zaradi tega je še posebej primeren zakompleksni peptidiinavtomatizirana sinteza.

TheFmoc metodapostopoma nadomestil metodo Boc kot glavno strategijo. Avtomatizirani peptidni sintetizatorji na osnovi obehFmoc in Boc kemijaso bili pozneje razviti in so poganjaliavtomatizacija sinteze peptidovter močno izboljša učinkovitost in ponovljivost.

 

4. Faza zrelosti in širitve (1990 do danes)

Optimizacija smole in reagenta:Razvojvisoko{0}}obremenjene, hidrofilne PEG-modificirane smolein učinkoviti spojni reagenti, kot nprHBTUinHATUje znatno izboljšal učinkovitost in izkoristek sinteze peptidov v trdni{0}}fazi (SPPS).

Tehnološka integracija:Novi pristopi, kot somikrovalovno{0}}podprto sintezoinpretočna kemijaso skrajšali reakcijske čase in dodatno povečali izkoristek.

 

Osnovna načela in potek dela SPPS:
Osnovno načelo sinteze peptidov v trdni{0}}fazi jestopenjska gradnja peptidne verige na trdnem nosilcu, z uporabozaščita skupinskih strategijinreakcije kondenzacije (spajanja).dosečiučinkovito in nadzorovano sestavljanje peptidov.

1. Vloga trdne podpore (smola) pri sintezi peptidov v trdni-fazi (SPPS)

A netopna polimerna smola-kot nprpolistiren-divinilbenzenska navzkrižno-povezana smola, Wangova smola ali Rink amidna smola-je izbran kot trdna podpora v SPPS. Smolna površina vsebujefunkcionalne skupine(npr. hidroksilne ali amino skupine), ki lahko nastanejokovalentne vezi z enim koncem peptidne verige, običajnoC-konec, ki pritrdi peptid na trdno oporo. Ta kovalentna pritrditev zagotavlja, da rastoči peptidostane vezan na smolo skozi celotno sintezo, kar močnoolajša nadaljnje reakcijske korake, pranje in čiščenje

 

2. Zaščita skupinske strategije pri sintezi peptidov v trdni{1}}fazi (SPPS)

Med sintezo peptidov se-amino skupina, karboksilna skupina in funkcionalne skupine reaktivne stranske-verigeaminokislin (kot so tiolne, karboksilne in amino skupine) so nagnjeni kstranske reakcije. Da preprečite te neželene reakcije,zaščitne skupinese uporabljajo. Skupne zaščitne skupine vključujejo:-Amino zaščitne skupine:

Boc (terc-butiloksikarbonil):Kislinsko-labilna, zlahka se odstrani podkisle razmere.

Fmoc (9-fluorenilmetiloksikarbonil):Stabilen v kislih pogojih, se lahko odstrani podosnovni pogoji(npr. raztopina piperidin/DMF).Zaščitne skupine-stranske verige:Izbrano glede na kemične lastnosti stranske verige aminokislin. pogoste skupine vključujejobenzil (Bn), terc-butil (tBu), tritil (Trt), itd. Te skupine soodstranimo na koncu sinteze, običajno med cepitvijo peptida iz smole, z uporabokisline ali drugih posebnih pogojev.

 

3. Sinteza C-konca do N-konca v SPPS

notersinteza peptidov v trdni{0}}fazi (SPPS)se sestavljanje peptidov običajno začne priC{0}}konec (karboksilni konec)in se postopoma nadaljuje protiN-konec (amino konec). To je zato, kerC-terminalna aminokislina je najprej pritrjena na trdno oporo, naslednje aminokisline pa se priklopijo naprosta amino skupina peptidne verige, ki je že vezana na smolo, postopoma podaljšuje peptidno verigo.

 

4. Reakcija spajanja pri sintezi peptidov v trdni-fazi (SPPS)

Zaščitene aminokisline morajo bitiaktivirantako da njihovokarboksilne skupine postanejo reaktivne, kar jim omogoča, da oblikujejo apeptidna vezz amino skupino na smolo-vezanega peptida. pogostaaktivacijski reagentivključitikarbodiimidi(npr. DCC, DIC),HOBt, HATU, inPyBOP. Ko je aktivirana, karboksilna skupina reagira s prosto amino skupino v akondenzacijska reakcija, ki tvori anamidna vezin s tem pritrditev nove aminokisline na rastočo peptidno verigo.

 

5. Ponavljajoče se (ciklične) operacije pri sintezi peptidov v trdni-fazi (SPPS)

Postopek vključujeponavljanje cikla odstranjevanje zaščite → spajanje → pranje, dodajanjeena aminokislina na cikelza postopno podaljševanje peptidne verige. Po vsakemreakcija spajanja, smola jeoprana(npr. s topili, kot sta DMF ali DCM), da odstranimo nezreagirane reagente, stranske-produkte in odvečne aminokisline. The-amino skupini na novo dodanega ostanka se nato odstrani zaščita, pri čemer izpostavimo prosti amin za pripravo na naslednjo reakcijo pripajanja. Ta cikel se ponavlja, dokler ni želeno peptidno zaporedje popolnoma sestavljeno.

 

6.Cepitev v trdni{1}}fazi peptidne sinteze (SPPS)

Ko peptidna veriga doseže želeno dolžino, jeodcepljen od trdne podporez uporabo ustreznega reagenta, hkratiodstranitev vseh zaščitnih skupin. Običajno uporabljen reagent za cepitev jetrifluoroocetna kislina (TFA), ki ne samoprekine vez med peptidom in smoloampak tudiodstrani zaščitne skupinekot sta Fmoc in Boc, obnavljanje peptida v njegovodomače stanje. Ko peptidna veriga doseže želeno dolžino, jeodcepljen od trdne podporez uporabo ustreznega reagenta, hkratiodstranitev vseh zaščitnih skupin. Običajno uporabljen reagent za cepitev jetrifluoroocetna kislina (TFA), ki ne samoprekine vez med peptidom in smoloampak tudiodstrani zaščitne skupinekot sta Fmoc in Boc, obnavljanje peptida v njegovodomače stanje.

S temi korakisinteza peptidov v trdni{0}}fazi (SPPS)omogočaučinkovito in nadzorovano sestavljanje peptidnih verig na trdnem nosilcu, izogibanje zapletenim vmesnim korakom čiščenja, ki so potrebni pri tradicionalni-fazni sintezi raztopine, in znatnoizboljšanje učinkovitosti in donosa sinteze.

S temi korakisinteza peptidov v trdni{0}}fazi (SPPS)omogočaučinkovito in nadzorovano sestavljanje peptidnih verig na trdnem nosilcu, izogibanje zapletenim vmesnim korakom čiščenja, ki so potrebni pri tradicionalni-fazni sintezi raztopine, in znatnoizboljšanje učinkovitosti in donosa sinteze.