Previdnostni ukrepi za uporabo ultrafiltracijske cevi
(1) Izberite ustrezno ultrafiltracijsko cev. Na splošno molekulska masa, ki jo je treba ohraniti, ne sme biti večja od 1/3 molekulske mase ciljne beljakovine. Na primer, če je molekulska masa ciljnega proteina 35 kDa, lahko izberete ultrafiltracijsko cev z molekulsko maso 10 kDa. Če je molekulska masa ciljnega proteina približno 10 kd, se lahko uporabi ultrafiltracijska cev z molekulsko maso 3KD. Pozorno preberite navodila za uporabo in bodite pozorni na različno toleranco ultrafiltracijske membrane na različne kemikalije.
(2) Na novo kupljena ultrafiltracija je suha. Pred uporabo dodajte ultra čisto vodo in voda bo popolnoma prešla skozi membrano. Za nekaj minut ga ohladite v ledeni kopeli ali v hladilniku. Nato odlijte vodo in dodajte raztopino beljakovin. Dodana količina ne sme preseči bele črte na vrhu epruvete. Operacija mora biti lahka. Pred dodajanjem beljakovinske raztopine je treba ultrafiltracijsko cev vstaviti na led za predhodno ohlajanje.
(3) Ravnotežje. Tako masa kot težišče morata biti uravnotežena. Upoštevajte, da hitrost in pospešek ne smeta biti prehitra, sicer bo ultrafiltracijska membrana neposredno poškodovana. Začnite s centrifugalno ultrafiltracijo (predhodno ohlajanje centrifuge na 4 stopinje). Ko se vrtljaji različnih centrifug pretvorijo v G, je drugačen. Nastavite pospešek centrifuge na najnižjo prestavo, da zmanjšate pritisk na membrano. Upoštevajte, da morate počakati, da centrifuga doseže ciljno hitrost, preden zapustite centrifugo, sicer, ko pride do težave s centrifugo, je ne morete obravnavati prvič. Smer membrane in vrtljive gredi je treba nastaviti v skladu z navodili (pri kotno vrtljivi centrifugi je membrana pravokotna na gred). Pri praktični uporabi je hitrost na splošno nižja od tiste v priročniku, kar lahko podaljša življenjsko dobo centrifugalne cevi.
(4) Ko se koncentrira do preostalega 1 ml, vzemite 50 ul puferske raztopine in dodajte 10 ul, da steče skozi, da vidite, ali postane modro, da ocenite, ali ultrafiltracijska cev pušča beljakovine. Če cev pušča, nalijte zgornjo plast in pretočite skozi novo cev ter začnite ultrafiltracijo. Za natančno presojo, ali epruveta pušča, centrifugirajte s 5 mg ml BSA 10 minut, nato pretočite skozi, uporabite beljakovinsko lepilo ali Bradford za grobo merjenje in še naprej dodajte preostalo raztopino beljakovin za koncentracijo (delujte na ledu, da preprečite, da bi se beljakovina segrevamo), dokler ne dodamo vseh koncentriranih raztopin. Bodite pozorni, ali med centrifugiranjem pride do obarjanja beljakovin, kar povzroči zamašitev cevi. Če pride do padavin, določite poseben vzrok za padavine, ali je koncentracija beljakovin previsoka ali je pufer neustrezen; Prvega je mogoče rešiti s hkratno ultrafiltracijo z več ultrafiltracijskimi cevmi za zmanjšanje koncentracije. Slednje je zamenjava različnih puferskih raztopin, dokler se beljakovina ne obori.
(5) Prejšnji koraki se uporabljajo za koncentracijo beljakovin. Če želite spremeniti pufer, ko je celotna raztopina beljakovin koncentrirana na približno 1 ml, nežno dodajte nov pufer (ultrafiltracija skozi 0.22um ultrafiltracijsko membrano) in nato trikrat zapored koncentrirajte na približno 1 ml. Končni volumen zadnje koncentracije je odvisen od zahtevane koncentracije beljakovin, ki običajno ni večja od 500ul, ali pa se lahko koncentrira na manj kot 200ul. Glede na vsakokratno volumsko koncentracijo vsaj 10-krat lahko doseže več kot 1000-krat trikrat, kar lahko v bistvu doseže namen spreminjanja pufra.
