Študija o sposobnosti odstranjevanja virusov monoklonskega protitelesa v nadaljnjem procesu
Pri biotehnoloških izdelkih, pridobljenih iz celičnih linij, je lahko tveganje okužbe z virusom – obseg je odvisen od številnih dejavnikov, vključno z virom priprave, uporabljenimi surovinami, proizvodnim sistemom, čistilnimi reagenti in pomožnimi snovmi. Preučevanje odstranitve oziroma inaktivacije virusov v procesu izdelave je ključni korak pri zmanjševanju možnosti iatrogenega prenosa patogenih virusov in s tem zmanjšanju tveganja, ki je bistveno za varnost izdelkov. Preden lahko biološki izdelki vstopijo v klinična preskušanja in se tržijo, je treba dokazati, da je njihov proizvodni proces zmožen odstraniti znane in domnevne viruse.
01 Ocena varnosti izdelka z monoklonskimi protitelesi proti virusu
Raziskave sposobnosti odstranjevanja virusa običajno potekajo z dodajanjem znanega virusa indikatorja titra vmesnemu proizvodu v različnih proizvodnih fazah, nato določanjem preostalega titra virusa v vzorcu, obdelanem s specifičnim postopkom, in končno ovrednotenjem vrednosti zmanjšanja log (LRV) titra virusa. Koraki postopka za LRV, ki je večji ali enak 4log10, na splošno veljajo za učinkovite korake odstranjevanja virusa. Postopek z LRV<41og10 can be considered as helpful to increase the total virus clearance in the production process. However, due to the limitations of virus verification, the process with LRV≤11og10 has little significance for virus removal, and its LRV value is not included in the total amount of the production process.
Pri uporabi metode simuliranega proizvodnega procesa (zmanjšani proces) je treba oblikovati razumen načrt raziskav in testiranja odstranjevanja/deaktivacije virusa, kolikor je to mogoče, povezan z dejanskim proizvodnim procesom, zlasti z učinkovitimi koraki proizvodnega procesa. Simulirani proces mora biti strogo skladen z dejanskim procesom v smislu preskusnih parametrov in kontrolnih pogojev.
02 Običajno označuje viruse in sheme preverjanja
Pogosti indikatorski virusi so prikazani v tabeli 1.
Na stopnji preiskovalne aplikacije za novo zdravilo (IND) biotehnološki izdelek zahteva študije očistka virusa za vsaj 2 modelna virusa, pri čemer se običajno izbere en retrovirus (X-MuLV) in en parvovirus (MMV). Med fazo vloge za licenco za biološka zdravila (BLA) se študije odstranjevanja virusov običajno izvajajo z uporabo 3-5 specifičnih/nespecifičnih virusov in 3-5 korakov postopka se ovrednoti, da se dokaže, da ima izdelek ustrezen varnostni faktor od z vidika virusne varnosti. Zaradi različnih smernic doma in v tujini obstajajo nekatere razlike v korakih preverjanja odprave virusa, ki se uporabljajo za deklaracije. Običajno uporabljene sheme za preverjanje očiščenja virusa v proizvodnem procesu mAb so prikazane v tabeli 2.
03 Zmogljivost odstranjevanja virusov v nadaljnjih procesih
3.1 Sposobnost nadaljnjih procesov za odstranjevanje različnih virusov
Od leta 2009 so izdelki z monoklonskimi protitelesi, predloženi FDA, za IND in BLA, afinitetno kromatografijo za protein A, nizek pH, anionsko izmenjevalno kromatografijo AEX (pretočni penetracijski način), kationsko izmenjevalno kromatografijo CEX (vezavni - elucijski način) in validacijo očistka virusa, razen virusna filtracija so najpogosteje uporabljene indikatorske družine virusov, povprečje in obseg njihovih učinkov očistka pa sta prikazana na sliki 1.
Za retroviruse, z izjemo CEX, ki ima LRV približno 3log10 (kot je prikazano v A-paličnem grafikonu na sliki 1), so bili drugi procesi robustni (LRV večji ali enak 4log10). Virusi herpesa in retrovirusi imajo podobne učinke očistka in LRV > 4log10 (kot je prikazano v stolpčnem grafikonu B na sliki 1). Majhne viruse brez ovojnice, kot je parvovirus, je težje učinkovito odstraniti, so odporni na kemično obdelavo in jih filtri ne zlahka ujamejo (prikazano v C-paličnem diagramu na sliki 1). Le AEX in majhni virusni filtri so bili učinkoviti pri odstranjevanju parvoviridae (povprečno LRV > 4log10).
Postopki, prikazani na sliki 1, so ProteinA, AEX (način prodiranja v tok), CEX (način sočasne elucije), inaktivacija z nizkim pH ("nepopolna" v primerjavi s "popolno" odstranitvijo) ter filtracija devirusa z veliko in majhno odprtino.
3.2 Vplivni dejavniki nadaljnjih procesov na zmožnost odstranjevanja virusov
Porazdelitev vrednosti LRV za vsak proces je prikazana na sliki 2. Študije z 0 ~ 21og10 so bile razvrščene kot nizka skupina LRV, tiste z več kot 6log10 pa so bile razvrščene kot skupina z visoko LRV za primerjalno analizo.
3.2.1 ProteinA afinitetna kromatografija
Med vrednostjo LRV postopka proteina A in pufrom za ravnotežje/pranje, polnilom, sestavo eluenta in pH vrednostjo elucije ni bilo pomembne korelacije. Skupni imenovalec skupine z nizko LRV je, da je surovina precej zapletena in lahko se zgodi, da kompleksna interakcija surovine in polnila negativno vpliva na sposobnost kromatografske kolone za odstranjevanje virusov.
3.2.2 AEX (pretočni način)
Strauss et al. je pokazalo, da lahko pH in prevodnost vzorcev AEX vplivata na LRV. Vendar pa so statistični rezultati Miesegaesa in drugih pokazali, da podobno kot pri proteinu A LRV AEX (način penetracije toka) ni imel pomembne korelacije z različnimi pufri, polnili, pH in prevodnostjo, kar je lahko posledica optimizacije pH in prevodnosti. v prijavljenih pogojih postopka postopka.
3.2.3 CEX (način vezave - elucije)
Odstranjevanje virusov s postopkom CEX ni dovolj robustno. Med LRV v skupini z visokim LRV in pufrom, ravnjo izkušenj ali lastnostmi kromatografske kolone, kot sta višina kolone in vrsta smole, ni bilo pomembne korelacije. Vendar pa sta bili vrednosti pH ravnotežja/obremenitve in elucije, uporabljeni v študiji visoke LRV, nižji, pri 5,3±0.2; V skupini z nizko LRV je bil pH 6.0±0.2. Drug dejavnik je, da lahko koncentracija soli v pufru povzroči tudi razliko v vrednosti LRV. Pufer, uporabljen v študiji z nizko LRV, je imel višjo koncentracijo soli s povprečno koncentracijo 290 ± 120 mM v raztopini za nalaganje/uravnavanje in 340 ± 70 mM v eluentu, medtem ko so bile koncentracije NaCl v študiji z visoko LRV 58 ±27 mM in 183±31 mM.
3.2.4 Inaktivacija nizkega pH
Pri postopku z nizkim pH je pH ključni procesni parameter in pH 3,8 zadostuje za inaktivacijo retrovirusa po stopnji. Skupina z nizko LRV je imela pH 3,9, študija z visoko LRV pa 3,4.
3.2.5 Odstranitev filtriranja virusov
Za filtre z majhno in veliko zaslonko vrednost LRV odstranitve MuLV ni bila manjša od 2log10 in le 1 % študij je bil pod 3log10 (prikazano v stolpcih h in i na sliki 2). Celoten očistek retrovirusov pri virusnih filtrih z veliko zaslonko je bil nižji kot pri virusnih filtrih z majhno zaslonko (kot je prikazano v C-paličnem grafikonu na sliki 1). Glavni razlog, ki vpliva na rezultat odstranjevanja parvovirusa, so različne vrste filtrov. Na splošno lahko protivirusno filtriranje zanesljivo odstrani viruse.
Procesi so protein A(a), način penetracije AEX (b), vezava CEX - način elucije (c), način elucije vezave AEX Ⅰ (d), inaktivacija z nizkim pH (" nepopolna "in" popolna "očiščenje) (e ~ g) in velika velikost por (h) in majhna velikost por (i ~ j) devirusna filtracija (kjer a ~ i: retrovirus; j: parvovirus).
04 Novosti in izzivi pri ocenjevanju virusne varnosti
Nenehen razvoj in inovacije na področju nadaljnjih biofarmacevtskih procesov bodo neizogibno prinesle inovacije pri ocenjevanju očistka virusa. Zaradi napredka v procesih navzgor in navzdol – kot so bioprocesi z neprekinjenim tokom – je bilo treba oceniti in vzpostaviti učinkovite in robustne postopke odstranjevanja virusov. Med neprekinjenim tokom se pričakuje, da bodo koraki, kot sta deaktivacija virusa in filtriranje virusa, še vedno izvedeni v paketnem načinu. Čeprav se zmožnost odstranjevanja virusa pri kromatografskih postopkih v načinu neprekinjenega toka ne bi smela bistveno razlikovati od sposobnosti šaržne obdelave, mora biti podprta s podatki.
05 Outlook
Z vidika virološke varnosti lahko odlično varnost biofarmacevtske industrije v veliki meri pripišemo strogemu spoštovanju industrije treh ključnih strategij za virusno varnost: ustrezno pridobivanje in testiranje virov materiala in celične banke, dokumentiranje ocen virusnega očistka (študije validacije virusa) in medprocesno virusno testiranje. Značilnosti bioloških zdravil, proizvedenih z novimi celičnimi substrati, se lahko spremenijo z različnimi tveganji, zato so za zagotovitev varnosti bioloških zdravil potrebne dobre strategije za obvladovanje tveganja. Guidling Technology ima izkušeno strokovno tehnično ekipo, ki pokriva postopek filtracije od majhnega poskusa, pilotnega poskusa do obsežne proizvodnje, naše membrane in membranski filtri se pogosto uporabljajo pri predfiltraciji, mikrofiltraciji, ultrafiltraciji, nanofiltracijski koncentraciji, ekstrakciji in ločevanju; Naše številne linije izdelkov, od majhnih laboratorijskih filtrov za enkratno uporabo do proizvodno usmerjenih filtrirnih sistemov, testiranja sterilnosti, fermentacije, celične kulture in več, zagotavljajo večjo produktivnost.
Jiuling, da bi zagotovil kakovost izdelkov kot prvi indikator, v prizadevanju za "zmanjšanje stroškov, povečanje učinkovitosti" na poti raziskovanja, se veselim sodelovanja z vami v prihodnosti, da se soočimo z izzivi industrije in iščemo boljši razvoj.
