Kratka razprava o več edinstvenih metodah votlih vlaken pri inkluzijskem čiščenju telesa

Inkluzijska telesca (IB) so netopni beljakovinski delci visoke gostote, oviti v membrane, ki nastanejo, ko se tuji geni izrazijo v prokariontskih celicah, zlasti v Escherichia coli. Ko ga opazujemo pod mikroskopom, je IB območje z visoko lomnostjo, ki se očitno razlikuje od drugih komponent v citoplazmi.

Tvorba inkluzijskih telesc je razmeroma zapletena, povezana s hitrostjo proizvodnje beljakovin v citoplazmi, koncentracija na novo ustvarjenih peptidov je visoka in ni dovolj časa za zvijanje, tako da nastanejo amorfni proteinski agregati. Inkluzijska telesca so v osnovi sestavljena iz beljakovin, od katerih je več kot 50% kloniranih produktov. Primarna struktura teh izdelkov je popolnoma pravilna, vendar je tridimenzionalna konfiguracija napačna, zato ni biološke aktivnosti. Velikost vključkov je 0.5-1μm, netopno v vodi, topno le v denaturantih, kot so sečnina, gvanidin hidroklorid itd.

V E. coli se lahko inkluzijska telesca pojavijo na dveh lokacijah celice: v citoplazmi in periferni citoplazmi. Lokacija in značilnosti inkluzijskih teles v celici so odvisne od tega, kako se proteini izražajo.

Vključki v citoplazmi E. coli imajo na splošno premer od {{0}}.2 do 1,5 μm, različni proteini pa imajo različne premere, na primer velikost interferona 0,811 μm in velikost prorennet je 1,281 μm. V nekaterih primerih je premer nekaterih inkluzijskih telesc večji od premera E. coli, zaradi česar E. coli izstopi. Na splošno ima celica samo eno inkluzijsko telesce.

 

Inkluzijsko čiščenje telesa

 

Postopek čiščenja inkluzijskega telesa je na splošno:

Drobljenje celic:

Splošna tehnologija drobljenja celic je: drobljenje tkiv pri visoki hitrosti, homogenizacija steklenega homogenizatorja, ultrazvočna obdelava, ponavljajoča se metoda zamrzovanja in odmrzovanja, kemična obdelava (običajno z uporabo lizocima).

 

Inkluzivno umivanje telesa:

Inkluzijska telesca so neaktivni trdni delci, ki nastanejo z znotrajcelično aglutinacijo proteinov, ki jih izražajo bakterije, ki običajno obstajajo v amorfni, netopni obliki. V inkluzijskih telescih predstavlja pravi ciljni protein le okoli 50 %, ostalo pa vsebuje lipide, lipopolisaharide, nukleinske kisline in heteroproteine, ki so vezani na inkluzijsko telesce in vplivajo na renaturacijo proteina inkluzijskih telesc. Zato je pranje pred denaturacijo zelo potreben korak.

Poleg tega je pranje inkluzijskih telesc koristno za povečanje izkoristka pri ponovnem zvijanju rekombinantnih proteinov. Z odstranitvijo nečistoč se lahko zmanjšajo ovire v procesu renaturacije, tako da se lahko beljakovina učinkoviteje zloži in pravilno sestavi, s čimer se izboljša aktivnost in funkcija beljakovine‌.

Pri pranju se običajno uporablja manj kot 1 % nevtralnega detergenta, kot so Tween, Triton, Urea in NP40 ter EDTA in reducenti 2-merkaptotreitol (DTT), -merkaptoetanol večkrat ponovljen, ker je pralna zmogljivost detergenta povečana z povečanje ionske jakosti raztopine, pri izpiranju inkluzijskih teles lahko dodamo NaCl za povečanje ionske moči.

Inkluzijska telesca se lahko uporabljajo za odstranitev drugih komponent raztopine za razgradnjo celic s centrifugiranjem ali filtracijo, pri čemer oba izkoriščata različne fizikalne lastnosti inkluzijskih teles.

 

Centrifugiranje:

Proteini inkluzijskih telesc so veliko gostejši od enake prostornine celičnih fragmentov, zato lahko inkluzijska telesca ločimo od preostale celice s centrifugiranjem. Kontinuirano centrifugiranje je najpogosteje uporabljena operacija za pridobivanje inkluzijskih teles v industrijski proizvodnji. Ker je gostota celičnih fragmentov manjša od gostote inkluzijskega telesca, je hitrost sedimentacije manjša kot pri inkluzijskem telescu. Neprekinjeno suspenzijo in centrifugiranje lahko centrifugira večino inkluzijskega telesca, medtem ko se delci celic postopoma odstranijo.
Filtracija (tangencialna pretočna filtracija) : Zaradi različnih molekularnih velikosti inkluzijskih teles in topnih beljakovin je mogoče uporabiti metodo filtracije, ki lahko zmanjša operativne stroške in olajša povečanje obsega. Tangencialno pretočno filtriranje (TFF) poganja transmembranska tlačna razlika. Snovi in ​​nečistoče, ki so manjše od velikosti por membrane, prehajajo skozi membrano, medtem ko se nečistoče, kot so celice z večjimi delci, ujamejo. Membranska odprtina, ki se običajno uporablja za filtracijsko pranje, je 0,1 μm. Tangencialna tokovna mikrofiltracija z votlimi vlakni se lahko neposredno spopade z visoko vsebnostjo trdnih snovi v tekočem materialu, manj korakov, preprosto delovanje, membrano je mogoče večkrat uporabiti s čiščenjem, zmanjšanjem naložb v opremo in obratovalnih stroškov, v skladu z zahtevami modularne avtomatizirane proizvodnje.

 

Sledi primer uporabe za pranje vključkov s stebri iz votlih vlaken Guidling.

Za koncentriranje 250 ml tekočine (molekulska masa ciljne beljakovine 17 kd) smo uporabili 94 cm2 0.1-0.45 μm votla vlakna. V celotnem procesu pranja so raziskovali stopnjo obnovitve ciljnega proteina in izčrpanost membranskega pretoka.

0-71min je postopek koncentracije, 71-224min je postopek pranja in filtracije. Med celotnim procesom mikrofiltracije se je TMP postopoma povečeval, vstopna hitrost tekočine je ostala nespremenjena, povprečni tok materiala pa je bil 12 LMH.

Rezultati so pokazali, da je bil ciljni protein popolnoma ujet, stopnja obnovitve ciljnega proteina pa je bila več kot 90-odstotna. Vodilni stebri iz votlih vlaken so stabilni in primerni za to uporabo.

 

Raztapljanje inkluzijskega telesa:

Inkluzijska telesca so na splošno raztopljena pod pogojem denaturacijskega sredstva sečnine ali gvanidin hidroklorida, raztopljeni proteini inkluzijskih teles pa so popolnoma denaturirani, kar pomeni, da razen primarne strukture in kovalentnih vezi ostanejo vse vodikove in hidrofobne vezi uničene in hidrofobne stranske verige so popolnoma izpostavljene.

Urea in gvanidin hidroklorid sta srednje močna denaturanta, ki ju zlahka odstranimo z dializo in ultrafiltracijo. Splošna koncentracija sečnine 8-10M, gvanidin hidroklorida 6-8M. Raztapljanje sečnine ima prednosti neionizacije, nevtralnosti, nizkih stroškov, odstranitev beljakovin po renaturaciji ne bo povzročila velike količine obarjanja beljakovin, raztopljena inkluzijska telesa pa je mogoče očistiti z različnimi kromatografskimi metodami, zato se pogosto uporablja .

 

Ponovno zvijanje beljakovin inkluzijskega telesa:

Raztopljeni rekombinantni protein mora biti pravilno zvit, da nastane funkcionalen protein. Tehnike za renaturacijo vključujejo redčenje beljakovinske raztopine na skoraj nevtralno, odstranitev denaturanta, renaturacijo na koloni in gelsko filtracijsko kromatografijo. Med njimi sta redčenje beljakovinske raztopine do skoraj nevtralne in odstranitev denaturanta pogosta klasična metoda renaturacije, zlasti metoda redčenja z renaturacijo ima najvišjo stopnjo izkoristka.

Odstranjevanje denaturanta:

Dializa: Prednost je v tem, da se volumen ne poveča, hitrost odstranjevanja denaturanta pa se nadzoruje s postopnim zmanjševanjem koncentracije zunanje prepustne tekočine, vendar traja dolgo in enostavno tvori neaktivne beljakovinske agregate, kar ni primerno za obsežno delovanje in ga ni mogoče uporabiti v obsegu proizvodnje.

Ultrafiltracija (TFF): enostaven za nadzor hitrosti dialize, bodisi v raziskavah in razvoju, pilotnem testiranju ali proizvodnji, lahko odstrani denaturante (sprememba tekočine + koncentracija) z ultrafiltracijo (TFF).

 

Inkluzijsko čiščenje telesnih beljakovin:

Metode čiščenja beljakovin po renaturaciji so podobne tistim pri čiščenju topnih beljakovin, in sicer ionsko izmenjevalna kromatografija, gelska filtracijska kromatografija, afinitetna kromatografija, obarjanje z izsoljevanjem amonijevega sulfata itd.

Inkluzijska telesca nimajo biološke aktivnosti, ni potrebe po skrbi zaradi izgube proteinske aktivnosti, velike količine izražanja pa ne bodo vodile do celične smrti in bodo povečale odpornost proti napadu proteaze. Votla vlakna Jiuling se lahko fleksibilno uporabljajo v procesu čiščenja inkluzijskih teles na koncu toka. V koraku pranja inkluzivnega telesa lahko odlična zmogljivost v primerjavi s centrifugalnim pranjem, uporaba votlih vlaken z mikrofiltracijo devetih starostnih tehnologij za pranje s filtracijo tangencialnega toka močno skrajša čas postopka, splošna stopnja okrevanja pa lahko doseže več kot 90 %. Votla vlakna Jiuling se lahko uporabljajo tudi v koraku renaturacije beljakovin inkluzijskih telesc. Motnost krmne tekočine, filtrirane z mikrofiltracijo votlih vlaken, se bo znatno zmanjšala, stopnja predelave beljakovin pa je visoka; Uporaba ultrafiltracijskih votlih vlaken ne more samo odstraniti denaturantov, temveč tudi skrajšati čas nalaganja kromatografskega vzorca, da prihrani čas, zmanjša količino polnila in zmanjša proizvodne stroške. Stopnja obnovitve mikrofiltracije/ultrafiltracije votlih vlaken se razlikuje glede na različne materiale in splošna stopnja obnovitve lahko doseže 90-95 %.

Guidling Technology vas vabi, da zahtevate testne komplete za povezane preglede.

 

O Guidlingu

Guidling Technology je nacionalno visokotehnološko podjetje, ki se osredotoča na biofarmacevtiko, celično kulturo, čiščenje in koncentracijo biomedicine, diagnostiko in industrijske tekočine. Uspešno smo razvili centrifugalne filtrirne naprave, ultrafiltracijske in mikrofiltracijske kasete, virusni filter, sistem TFF, globinski filter, votla vlakna itd., ki v celoti izpolnjujejo scenarije uporabe biofarmacevtskih izdelkov, celične kulture itd. Naše membrane in membranski filtri se pogosto uporabljajo pri koncentraciji, ekstrakciji in ločevanju predfiltracije, mikrofiltracije, ultrafiltracije in nanofiltracije. Naše številne linije izdelkov, od majhnih laboratorijskih filtrov za enkratno uporabo do proizvodnih filtracijskih sistemov, testiranja sterilnosti, fermentacije, celične kulture in več, izpolnjujejo potrebe testiranja in proizvodnje. Guidling Technology se veseli sodelovanja z vami!