Vodnik za kakovostno rekombinantno čiščenje beljakovin: Aplikacije za optimizacijo procesa na nižji stopnji in aplikacije za filtracijo tangencialnega pretoka
Rekombinantne beljakovine se pogosto uporabljajo v biofarmacevtskih smeri, razvoju cepiva in in vitro diagnostiki . Njihova kakovost čiščenja neposredno vpliva razširljivost vse bolj postaja vitalno orodje pri delovnih tokovih za čiščenje beljakovin .
Ta članek sistematično opisuje ključne korake pri čiščenju rekombinantnih beljakovin na nižji stopnji, s poudarkom na aplikacijskih strategijah tehnologije TFF .
I . jedrski koraki pri čiščenju rekombinantnih beljakovin na nižji stopnji
1. spravila celic in liza
Centrifugiranje/globinska filtracija: odstrani celične naplavine in nečistoče; Primerno za bakterijsko, kvas itd. ., ekspresijski sistemi .
Sonication/visokotlačni homogenizacija: prekine celice, da sprosti ciljne beljakovine; Pogoji zahtevajo optimizacijo za preprečevanje denaturacije beljakovin .
Encimska liza: E . g ., zdravljenje z lizocimom za bakterije; nežni pogoji, vendar višji stroški .
2. Primarno čiščenje: zajem ciljnega proteina
Affinostna kromatografija (E . g ., His-TAG, protein A/G): Vezava visoke specifičnosti; doseže visoko čistost v enem koraku .
Ionska izmenjava kromatografija (IEX): ločuje beljakovine na podlagi razlik na naboju; Primerno za čiščenje zgodnje do sredine .
Hidrofobna interaktivna kromatografija (HIC): uporablja razlike v hidrofobnosti površine beljakovin; Učinkovito za nekatere težke beljakovine .
3. poliranje: izboljšanje čistosti
Kromatografija iz ekskluzije velikosti (SEC): odstranjuje agregate in majhne molekulske nečistoče; Omejena zmogljivost nalaganja .
Multimodalna kromatografija (E . g ., Capto AdHere): združuje več načinov interakcije za višjo ločljivost .
4. koncentracija in izmenjava medpomnilnikov
Ultrafiltracijske centrifugalne naprave: primerne za majhne vzorce; nagnjen k izgubi beljakovin .
Tangencialna filtracija pretoka (TFF): Učinkovita, razširljiva, idealna za industrijsko proizvodnjo (podrobno kasneje) .
5. sterilizacija in shranjevanje
0 . 22 µm filtracija: odstrani mikroorganizme, ki zagotavljajo sterilnost.
Dodatek stabilizatorjev (E . g ., glicerol, BSA): preprečuje razgradnjo beljakovin .
II . Ključne aplikacije filtracije tangencialnega pretoka (TFF) pri čiščenju na nižji stopnji
Tangencialna filtracija (TFF) zmanjšuje membransko prelivanje s tangencialnim tokom, zaradi česar je primerna za koncentracijo, razsoljevanje in izmenjavo vzorcev velikega volumna ..
1. Prednosti tehnologije TFF
✔ Visoko okrevanje: Minimizira izgube adsorpcije beljakovin, zlasti ključne za dragocene vzorce .
✔ Linearna razširljivost: uporabna od laboratorijske lestvice (10 ml) do proizvodne lestvice (1000L+) .
✔ Prilagodljivost procesa: En sam sistem lahko izvede koncentracijo, dializo (izmenjava medpomnilnika) in diafiltracijo .
2. TFF kaseta/Vodnik za izbiro membrane
|
Membranski material |
Značilnosti |
Scenariji prijave |
|
Polyethersulfone (PES) |
Nizka vezava beljakovin, kemično stabilna (odporna na pH), visok tok |
Ostri varovalni pogoji |
|
Regenerirana celuloza (RC) |
Nizka vezava beljakovin, visok tok, rutinski protein |
Rutinsko čiščenje beljakovin/protiteles |
Smernice za izbiro molekulske mase (MWCO):
1/3 do 1/5 molekulske mase ciljnega proteina (e . g ., uporabite 10 kDa membrano za 30 kDa protein) .
Če želite odstraniti agregate, izberite manjšo velikost pore (E . g .
3. Optimizacija kritičnih delovnih parametrov TFF
Transmembranski tlak (TMP): običajno 3–15 psi; Prekomerno visok TMP spodbuja fuling .
Tangencialni pretok: vzdržuje turbulenco, da zmanjša polarizacijo koncentracije; Običajno 4–8 l/min · m² .
Tehnike izboljšanja donosa:
Med diafiltracijo za popolno izmenjavo . uporabite 2–5 količine medpomnilnika
Na koncu izvedite povratno cvetje, da obnovite preostali protein .
4. Tipična študija primera: Čiščenje monoklonskega protitelesa (MAB)
Pojasnjena tekočina celične kulture → Protein A afinitetna kromatografija → virusna inaktivacija z nizkim pH → koncentracija TFF + izmenjava pufra → poliranje (sec/iex) → sterilna filtracija
Vloga TFF:
Hitro koncentrira razredčen protein A eluate na ciljno koncentracijo .
Izmenjuje medpomnilnik na PBS ali formulacijski medpomnilnik (E . g ., histidinski medpomnilnik) .
Iii . Pogoste težave in rešitve
❌ Problem 1: Obnovitev nizkega beljakovin
Možni vzroki: adsorpcija membrane; padavine zaradi prekomerne koncentracije .
Rešitve: preklopite na nizko vezavno membrano; Dodajte površinsko aktivno sredstvo (E . g ., 0 . 01% Tween 20).
❌ Problem 2: Hitro upadanje toka
Možni vzroki: polarizacija membrane ali koncentracije .
Rešitve: optimizirajte tangencialni pretok; izvajati redno odvajanje hrbta; Preklopite na bolj odprto membransko strukturo (E . g ., 30 kDa namesto 10 kDa) .
❌ Problem 3: združevanje beljakovin
Možni vzroki: prekomerna strižna sila; neprimeren medpomnilnik .
Rešitve: zmanjšanje hitrosti črpalke; Uporabite Gentler Bufers (E . g ., ki vsebuje sarozo ali NACl) .
IV . povzetek
Obtaining high-quality recombinant proteins relies on optimizing downstream purification processes. Tangential Flow Filtration (TFF) technology, with its efficiency and scalability, has become a critical tool for concentration and buffer exchange. By rationally selecting membrane cassettes, optimizing operational parameters, and integrating chromatography techniques, both protein purity and yield can be znatno izboljšano, izpolnjevanje zahtev tako raziskovalne kot industrijske proizvodnje .