Uporaba ultrafiltracije pri ekstrakciji naravnega kolagena

Kolagen kot naravni beljakovinski vir ima dobro biokompatibilnost, nizko antigenost, biorazgradljivost in hemostazo, tesno spiralno strukturo in lastne značilnosti, kar vse zagotavlja predpogoje za njegovo industrializacijo. Kolagen in njegovi stranski produkti se ne uporabljajo le kot embalažni material, kozmetični izdelki in izdelki za zdravstveno nego, temveč tudi kot aditivi za živila za izboljšanje mesnih izdelkov, pomembno vlogo pa ima predvsem na medicinskem področju.

 

Kaj je kolagen?

 

Kolagen je biološka makromolekula, glavna sestavina živalskega vezivnega tkiva ter najbolj zastopana in razširjena funkcionalna beljakovina pri sesalcih, saj predstavlja 25 do 30 % skupnih beljakovin, pri nekaterih organizmih pa celo do 80 % ali več. Ima vlogo vezivnega tkiva v živalskih celicah.

Izmerjeno je, da ima telo odraslega približno 3 kg kolagena, ki je v glavnem v človeški koži, kosteh, očeh, zobeh, kitah, notranjih organih (vključno s srcem, želodcem, črevesjem, krvnimi žilami) in drugih delih človeškega telesa. funkcija je ohranjanje morfologije in strukture kože ter tkiv in organov, poleg tega pa je pomembna surovina za obnovo različnih tkiv po poškodbah.

 

Obstaja veliko vrst kolagenskih beljakovin, pogosti tipi pa so tip I, tip II, tip III, tip V in XI. Zaradi svoje dobre biokompatibilnosti, biorazgradljivosti in bioaktivnosti se kolagen pogosto uporablja v prehrani, medicini, tkivnem inženiringu, kozmetiki in na drugih področjih.

Kako pridobiti naravni kolagen

Živalska tkiva živine in perutnine so glavni način za pridobivanje naravnega kolagena in njegovih kolagenskih peptidov. Vendar pa je zaradi povezanih živalskih bolezni in določenih verskih prepričanj uporaba kolagena in njegovih produktov iz kopenskih sesalcev pri ljudeh omejena, razvoj pa se postopoma usmerja k morskim organizmom. Evropska agencija za varnost hrane (EFSA) je potrdila, da tudi kolagen, pridobljen iz živalskih kosti, nima potenciala za okužbo z boleznijo norih krav in drugimi sorodnimi boleznimi. Zaradi razlik v aminokislinski sestavi in ​​stopnji zamreženja imajo vodne živali, zlasti kolagen, bogat z odpadki njihove predelave, kot so koža, kosti in luska, številne prednosti, ki jih živalski kolagen nima. Poleg tega je kolagen, pridobljen iz morskih živali, očitno boljši od kolagena iz kopenskih živali v nekaterih vidikih, kot sta nizka antigenost in hipoalergenost. Zato lahko vodni kolagen postopoma nadomesti kolagen kopenskih živali. Za primer smo vzeli postopek pridobivanja kolagena iz ribjih lusk amurja.

 

Ekstrakcija kolagena iz ribjih lusk amurja z metodo ultrafiltracije

1. Materiali in metode

1.1 Preskusni vzorec

Surovi vodni ekstrakt kolagena.

1.2 Preskusne metode

1.2.1 Postopek ultrafiltracije

 

1.2.2 Določitev postopka predfiltracije

V tem preskusu se primerjata in analizirata metoda vakuumske filtracije in metoda mikrofiltracije, da se določi najboljši postopek filtracije pred filtracijo. Posebne preskusne metode so naslednje:

① Surovi vodni ekstrakt kolagena je bil filtriran z vakuumskim črpanjem filtrirnega papirja, da se odstranijo suspendirani delci in nečistoče v vodnem ekstraktu.

② Surovi vodni ekstrakt kolagena je bil filtriran z 0.2μm mikrofiltracijsko membrano, da se odstranijo netopne snovi in ​​nečistoče v vodnem ekstraktu.

 

1.2.3 Izbira velikosti por ultrafiltracijske membrane

Velikost por ultrafiltracijske membrane je bila 100 kDa.

 

1.2.4 Poskus z enim faktorjem postopka čiščenja z ultrafiltracijo

Tehnologija ultrafiltracije je bila uporabljena za čiščenje surovega vodnega ekstrakta kolagena in proučeni so bili enofaktorski eksperimenti o učinkih delovnega tlaka, delovne temperature in pH vrednosti na zadrževanje kolagena. Potem ko je bila oprema za ultrafiltracijo nekaj časa vklopljena in stabilizirana, so proučevali vpliv različnih dejavnikov na zadrževanje kolagena.

 

1.2.5 Formula za izračun

 

2. Rezultati in analiza

2.1 Rezultati analize postopka predfiltracije

Rezultati primerjave obeh metod filtracije vakuumske ekstrakcije in mikrofiltracije so prikazani v naslednji tabeli.

 

Iz tabele je razvidno, da lahko tako metoda vakuumske filtracije kot metoda mikrofiltracije odstranita nečistoče in netopne trdne snovi v raztopini, vendar ima metoda mikrofiltracije boljši zaščitni učinek na beljakovine, kar pomeni, da izguba ni očitna, metoda vakuumske filtracije pa je lahko povzroči izgubo beljakovin. Poleg tega se pri metodi vakuumske filtracije pojavi motnost, potem ko je filtrat postavljen za nekaj časa, mikrofiltrat pa je še vedno čist in prozoren, zato je mikrofiltracija izbrana kot postopek predhodne obdelave ultrafiltracije.

 

2.2 Enofaktorski test procesa ultrafiltracije

2.2.1 Vpliv ultrafiltracijskega tlaka na stopnjo zadrževanja

Pod pogojem temperature 40 stopinj in pH=9.0, vpliv različnih ultrafiltracijskih tlakov (0.07MPa, {{9} }.09 MPa, 0,11 MPa, 0,13 MPa in 0,15 MPa) so preučevali na zadrževanje beljakovin. Rezultati so prikazani na spodnji sliki.

Kot je razvidno iz zgornje slike, se s povečanjem delovnega tlaka stopnja zadrževanja beljakovin postopoma zmanjšuje. Ko je delovni tlak {{0}}.07 MPa, je stopnja zadrževanja beljakovin 96,53 %, ko je delovni tlak 0,15 MPa, je stopnja zadrževanja beljakovin 84,38 %. To je zato, ker se učinek ločevanja ultrafiltracije na snovi izvaja z razliko v tlaku. V območju nizkega delovnega tlaka lahko majhne molekule hitro prehajajo skozi membrano, medtem ko lahko velike molekule ujame ultrafiltracijska membrana in se kopičijo na površini membrane. V tem času površina membrane in vodni ekstrakt tvorita koncentracijsko razliko, kar ima za posledico koncentracijsko polarizacijsko odpornost. V tem času je pritisk razmeroma nizek in ne more imeti velikega vpliva na stopnjo zadrževanja. Vendar pa s povečanjem tlaka koncentracijski polarizacijski upor postopoma narašča in koncentracijska razlika med površino membrane in vodnim ekstraktom doseže ravnovesje. Ko tlak preseže to ravnotežje, se lahko na površini membrane oblikuje plast gela (kar je skladno s teorijo, da med ultrafiltracijo nastaneta koncentracijska polarizacija in kondenzacijska plast), tlak pa še naprej narašča, debelina plasti gela se povečuje. , poveča pa se tudi količina beljakovin, ki ostanejo na površini membrane. Posledica tega je nižja stopnja zadrževanja. Da bi zagotovili učinek ločevanja membrane, je optimalni parameter delovnega tlaka 0,07MPa.

 

2.2.2 Vpliv temperature na zadrževanje beljakovin

V pogojih tlaka {{0}}.11MPa in pH=9.0 so učinki različnih temperatur, in sicer 25 stopinj, 30 stopinj, 35 stopinj, 40 stopinj in 45 stopinj, na beljakovine retencijo. Rezultati so prikazani na spodnji sliki.

Kot je razvidno iz zgornje slike, stopnja zadrževanja ultrafiltracijske membrane postopoma narašča s povišanjem temperature in doseže največjo vrednost pri 45 stopinjah, s stopnjo zadrževanja 97,01 %. To je zato, ker je viskoznost kolagena tesno povezana s temperaturo. Ko je temperatura nizka, je viskoznost kolagena večja, kopičenje kolagena na površini membrane pa zlahka tvori odpornost, kar ima za posledico nizko stopnjo zadrževanja. Ko se temperatura poveča, se viskoznost kolagena zmanjša, interakcija med molekulami kolagena se oslabi, hitrost prenosa mase se poveča, pojav koncentracijske polarizacije oslabi in stopnja zadrževanja se poveča. Drug razlog za povečanje stopnje zadrževanja je, da se temperatura poveča, ustrezno se poveča tudi topnost kolagena in se zmanjša pojav kolagena, ki blokira membrano, zato je optimalna temperatura ultrafiltracije 45 stopinj.

 

2.2.3 Vpliv pH vrednosti na zadrževanje beljakovin

V pogojih tlaka {{0}}.11MPa in temperature 40 stopinj je vpliv različnih pogojev pH, in sicer pH=6.0, pH{{ 5}}.{{10}}, pH=8.0, pH=9.0 in pH=10.0, na stopnjo zadrževanja so proučevali. Rezultati so prikazani na spodnji sliki.

 

As can be seen from the figure above, in the range of pH 6-7, the protein retention rate decreases with the increase of pH value, and the minimum value is 82.13% when pH=7.0; when pH>7, the retention rate gradually increases with the increase of pH value. This is because the isoelectric point of collagen is pH=7. At the isoelectric point, the protein is in a state of precipitation, which is easy to stay on the surface of the membrane and block the membrane, thus reducing the retention rate. When pH>7, stopnja zadrževanja postopoma narašča s povečanjem pH vrednosti. To je zato, ker je ultrafiltracijska membrana polieter javorjeva membrana z negativnim nabojem, kolagen pa je v alkalnih pogojih negativno nabit. Negativno nabite molekule kolagena tvorijo medsebojno izključujoče stanje z ultrafiltracijsko membrano z enakim nabojem, zato molekulam kolagena ni lahko ostati na površini membrane in blokirati membrano. Zato je optimalna pH vrednost ultrafiltracije 8-10.

 

2.3 Optimizacija procesa ultrafiltracije in preverjanje rezultatov

Po analizi programske opreme Design-Expert8.05 so optimalni procesni parametri: delovni tlak 0.14MPa, delovna temperatura 40.98 stopinj, pH raztopine{{7 }}.43, stopnja zadrževanja pa je 92,551 %. Glede na delovanje dejanskih parametrov so bili izbrani pogoji ultrafiltracije kot delovni tlak 0,14 MPa, delovna temperatura 40 stopinj in pH vrednost raztopine materiala 9,50, preverjanje preskusa pa se je začelo po zagonu in stabilizaciji ultrafiltracijskega sistema. Rezultat stopnje zadrževanja je bil (92,61±0,1) % (n=3). Predvidene vrednosti enačbe so v bistvu podobne izmerjenim vrednostim, kar kaže, da se napovedani rezultati parametrov stanja ujemajo z rezultati dejanskega stanja.

 

2.4 Rezultati elektroforetske analize

Očiščen kolagen smo analizirali z elektroforezo SDS-PAGE, rezultati pa so prikazani na naslednji sliki.

 

Kot je razvidno iz zgornje slike, je pas 1 očiščen kolagen tega testa, pas 2 pa standardni vzorec kolagena telečjih tetiv. Iz elektroforeze SDS-PAGE je razvidno, da je kolagen v tej študiji mogoče identificirati kot kolagen, vendar se zdi, da meje med peptidno verigo a1 in peptidno verigo a2 niso jasne. Iz elektroforetske karte je razvidno, da ni drugih beljakovinskih nečistoč, zato lahko sklepamo, da je očiščen kolagen visoke čistosti.

O Guidlingu

 

Guidling Technology je nacionalno visokotehnološko podjetje, ki se osredotoča na biofarmacevtiko, celično kulturo, čiščenje in koncentracijo biomedicine, diagnostiko in industrijske tekočine. Uspešno smo razvili centrifugalne filtrirne naprave, ultrafiltracijske in mikrofiltracijske kasete, virusni filter, sistem TFF, globinski filter, votla vlakna itd., ki v celoti izpolnjujejo scenarije uporabe biofarmacevtskih izdelkov, celične kulture itd. Naše membrane in membranski filtri se pogosto uporabljajo pri koncentraciji, ekstrakciji in ločevanju predfiltracije, mikrofiltracije, ultrafiltracije in nanofiltracije. Naše številne linije izdelkov, od majhnih laboratorijskih filtrov za enkratno uporabo do proizvodnih filtracijskih sistemov, testiranja sterilnosti, fermentacije, celične kulture in več, izpolnjujejo potrebe testiranja in proizvodnje. Guidling Technology se veseli sodelovanja z vami!